Ресанта асн 5000 н 1 ц инструкция схема подключения — Строительный портал №1

Бывают случаи, когда нам необходимо качественно стабилизировать напряжение в сети, чтобы защитить технику от губительного скачка напряжения или токов короткого замыкания.

Для этого существуют устройства, которые предотвращают выход из строя бытовой и офисной техники при наличии сбоя в электрических сетях.

Чтобы правильно рассчитать, достаточно ли конкретного прибора для всех потребителей, необходимо учитывать сумму их мощностей (пусковых токов) с небольшим запасом мощности.

Обеспечить безопасную работу всех энергопотребителей квартиры или офиса поможет схема стабилизатора напряжения Ресанта.

Электромеханическая модель, выпущенная этой компанией, справляется с большим диапазоном погрешности входного напряжения, приводя и недостаточные 140 В и повышенные 260 В к необходимым 220 В. На выходе данное устройство дает совсем небольшую допустимую погрешность до 8%.

Мощность всей подключенной через стабилизатор электрической техники в сумме не должна превышать 10000 Вт. Для правильных расчетов необходимо принять во внимание, что при пониженном напряжении на входе падает и выходная мощность питания энергопотребителей.

В конструкции этого стабилизатора напряжения присутствует ступенчатый автотрансформатор и набор тиристорных ключей. В том случае, если входное напряжение отличается от нормы в 220 вольт, от встроенного микропроцессора на тиристорные ключи поступает команда активации процесса перекоммутации цепи. Поданная команда выполняется за время до 20 мс, при этом напряжение на выходе сохраняется в пределах допустимого.

Однофазный стабилизатор напряжения электронного типа Ресанта АСН-5000/1-Ц 63/6/6

Особенности модели:

• Сохранение работоспособности однофазных электроприборов низкой и средней мощности при установке в отапливаемом помещении;
• Наличие цифрового дисплея для индикации показаний работы стабилизатора;
• Регулировка выходного напряжения в широком диапазоне без искажения формы сигнала;
• Высокое быстродействие и автоматическое отключение нагрузки при превышении предельного значения входного тока;
• Автоматическое отключение нагрузки при превышении предельного значения выходного напряжения.

Принцип работы

Регулировка напряжения происходит за счет переключения обмоток на трансформаторе при помощи реле. Поэтому данный вид стабилизаторов называется «релейный». Осуществляется ступенчатая регулировка. При ступенчатой регулировке точность выходного напряжения возрастает до 8%, это 17,6 В, что вполне безопасно для всех бытовых приборов, по ГОСТ допустимо 10%. Но за счет этого сокращается время регулировки, оно минимально и составляет менее 15 миллисекунд, то есть менее 1 секунды! Такой стабилизатор стоит устанавливать в места где входное напряжение постоянно изменяется.

Общие сервисные функции стабилизатора

• Регулировка выходного напряжения в широком диапазоне, дискретным способом без искажения формы сигнала.
• Широкий диапазон входных напряжений 140-260 В.
• Высокое быстродействие.
• Контроль над выходным напряжением с помощью встроенного в корпус вольтметра.
• Автоматическое отключение нагрузки при превышении предельных значений выходного напряжения (максимального и минимального).
• Автоматическое отключение нагрузки при коротком замыкании.
• Автоматическое подключение нагрузки при восстановлении выходного напряжения в пределах рабочего диапазона.
• Индикация режимов работы.

Стабилизатор Ресанта ACH-5000/1-Ц имеет мощность 5 кВт, данной мощности хватает, чтобы питать отдельные потребители, или несколько потребителей, но суммарное потребление не должно превышать установленный мощностной номинал. Диапазон входных напряжений стабилизатора 140-260 Вольт, но при понижении входного напряжения ниже 190 Вольт начинается потеря выходной мощности, при минимальном входном напряжении 140 Вольт выходная мощность сократиться на 50% и составит 2,5 кВт.

При длительных превышениях допустимых значений входного напряжения система защиты отключит выходное напряжение, а сам стабилизатор уйдет в режим защиты. При перегреве стабилизатора так же произойдёт аварийное отключение выходного напряжения. Максимальное температурное значение обмотки трансформатора может достигать 70 °С, нагрев трансформатора напрямую зависит от температуры окружающей среды. Стабилизатор так же защищён от короткого замыкания при помощи предохранителя.

Стабилизаторы напряжения, оборудованы LCD-дисплеями. Ниже представлено схематичное изображение дисплея с указанием всех индикаторов.

1. Задержка — индикатор активен при включении стабилизатора и при срабатывании одной из защит, (низкое/высокое напряжение, перегрев, перегрузка). Дополнительно на дисплее отображается обратный отсчет времени задержки.
2. Работа — индикатор активен постоянно при включенном устройстве.
3. Защита — индикатор активен при срабатывании одной из защит.
4. Индикатор нагрузки — изменяется пропорционально току нагрузки.
5. Гиря — часть индикатора нагрузки — индикатор активен постоянно при включенном устройстве.
6. Ресанта – индикатор появляется при включении (буква за буквой), и активен постоянно при включенном устройстве.
7. Перегрев — индикатор активен при срабатывании защиты от перегрева.
8. Перегрузка — индикатор активен при срабатывании защиты от перегрузки.
9. Пониженное напряжение — индикатор активен при выходном напряжении
10. Строка состояния — представляет собой 8 точек. При включении каждая точка соответствует 1 секунде задержки при включении.
11. Повышенное напряжение — индикатор активен при выходном напряжении >245 В.
12. Входное напряжение — отображает входное напряжение.
13. Выходное напряжение — отображает выходное напряжение.

Электрическая схема ресанта асн-5000 1-ц

Электрическая схема ресанта асн-5000 1-ц

Купить стабилизатор релейный ресанта асн-5000/1-ц в.

Стабилизатор напряжения ресанта асн-5000/1-ц купить.

Ресанта асн-5000/1-ц: купить в москве сравнить цены на.

Ресанта асн-5000/1-ц: купить в санкт-петербурге сравнить.

Ремонт стабилизаторов напряжения ресанта несложное дело.

Стабилизатор напряжения ресанта ach-5000/1-ц.

Гидрогель с модифицированным доменом C IGF-1 усиливает клеточную терапию для AKI

Abstract

Низкое удержание клеток и приживление после трансплантации ограничивают успешное применение терапии стволовыми клетками для AKI. Сконструированные микроокружения, состоящие из гидрогелевой матрицы и факторов роста, становятся все более успешными в управлении судьбой стволовых клеток, имитируя компоненты ниш нативных стволовых клеток. Здесь мы синтезировали биоактивный гидрогель путем иммобилизации пептида C-домена IGF-1 (IGF-1C) на хитозане, и мы предположили, что этот гидрогель может обеспечить благоприятную нишу для мезенхимальных стволовых клеток (ADSC), полученных из жировой ткани, и, таким образом, усилить клеточную активность. выживаемость в модели AKI. Исследования in vitro показали, что по сравнению с отсутствием гидрогеля или только гидрогеля хитозана, гидрогель хитозан-IGF-1C увеличивал жизнеспособность клеток за счет паракринных эффектов. In vivo , котрансплантация гидрогеля хитозан-IGF-1C и ADSC в ишемизированные почки улучшила функцию почек, вероятно, за счет наблюдаемого повышения выживаемости стволовых клеток и ангиогенеза, что визуализировано с помощью биолюминесцентной визуализации и ослабления фиброза. В заключение, IGF-1C, иммобилизованный на хитозановом гидрогеле, обеспечивает искусственное микроокружение для ADSC и может быть многообещающим терапевтическим подходом для AKI.

Заболевания почек связаны со значительной заболеваемостью и смертностью. Восстановление поврежденной почечной ткани важно для лечения ОПН, а также для замедления прогрессирования ХБП в ХПН. ^1–3 Хотя почка является хрупким органом и имеет лишь ограниченную способность к регенерации по сравнению с другими органами, недавние достижения в исследованиях стволовых клеток предполагают возможность использования стволовых клеток для регенерации почек. ² Несколько типов стволовых клеток, таких как эндотелиальные клетки-предшественники, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, были применены для регенерации почек. ^1,4–7 Однако терапия стволовыми клетками частично ограничена низкой скоростью приживления трансплантата после трансплантации. ^8,9

Разработанные матрицы с гидрогелем и фактором роста, имитирующие компоненты ниши стволовых клеток, были использованы в качестве носителей для доставки клеток для предотвращения апоптоза клеток, вызванного аноикисом. ^9–11 Внешние клеточные факторы, включая растворимые и иммобилизованные факторы, наряду с компонентами внеклеточного матрикса (ЕСМ) и сигналами, представляемыми соседними клетками, обеспечивают ключевые регуляторные сигналы для самообновления и дифференцировки стволовых клеток. ¹² Ковалентная иммобилизация факторов роста на матрицах биоматериалов приведет к увеличению локальных концентраций белка за счет препятствования диффузии; следовательно, рецептор-опосредованный эндоцитоз приведет к более высокой удельной биологической активности. ^12–14

Синтетические пептиды, разработанные для имитации биологических свойств исходных белков, могут обеспечить клинические преимущества, аналогичные эффектам полноразмерных факторов роста, с преимуществами снижения затрат и лучшей стабильности. ¹⁵ В растущем числе исследований использовались имитирующие пептиды, такие как RGD (Arg-Gly-Asp), QK (15-аминокислотный пептид, имитирующий область связывания рецептора фактора роста эндотелия сосудов) и QHREDGS (Gln- His-Arg-Glu-Asp-Gly-Ser) для замены факторов роста, фибронектина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и ангиопоэтина-1, соответственно, для увеличения биологической активности сконструированных матриц. ^16–18 Инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) состоит из 70 аминокислот в одной цепи с доменами A и B, разделенными доменом C и карбокси доменом D. ¹⁹ IGF-1 является мощным митогенным фактором и фактором выживания, который играет ключевую роль в восстановлении почек в клинических условиях. ^20,21 Пептид C домена IGF-1 (IGF-1C), 12-аминокислотная последовательность GYGSSSRRAPQT, был идентифицирован как активная область белка IGF-1 ²² и имеет отношение к ускорению заживления эпителиальные раны роговицы. ¹⁹ Это свидетельство приводит к нашей гипотезе о том, что IGF-1C обладает терапевтическими эффектами, аналогичными таковым у их полноразмерных аналогов.Поэтому мы разработали инъекционный гидрогель на основе хитозана (CS) с иммобилизованным IGF-1C (CS-IGF-1C) для усиления поддерживающей функции ниши, способствующей выживанию и терапевтическим преимуществам трансплантированных мезенхимальных стволовых клеток (ADSC), полученных из жировой ткани, у мышей. модель AKI.

Результаты

Характеристика гидрогеля CS – IGF-1C

IGF-1 участвует в качестве важного медиатора регенерации почек ²³ и C-домен IGF-1 (IGF-1C), 12-аминокислотная последовательность GYGSSSRRAPQT (Дополнительный рисунок 1A).Он также играет митогенную и способствующую выживанию роль в заживлении ран после травм. ¹⁹ Чтобы исследовать, может ли иммобилизация IGF-1C усиливать терапевтические эффекты стволовых клеток, IGF-1C был трансплантирован на боковую цепь CS для получения CS-IGF-1C (Рисунок 1A). Успешное связывание IGF-1C с боковой группой алкинилзамещенного CS было подтверждено с помощью инфракрасного спектроскопического анализа с преобразованием Фурье (FT-IR). Оба пика, связанные с алкинильной группой (удлинение 3082 см, ^-1, ≡CH и растяжение 2102 см, ^-1, ° C), исчезли и уменьшились.Кроме того, пики при 2831 и 1172 см ^-1 наблюдались в результате C-H-растяжения метиленовой и метильной групп и C-O-растяжения гидроксильной группы в привитом сегменте IGF-1C (рис. 1B). Это открытие указывает на иммобилизацию IGF-1C на боковой группе алкинилзамещенного CS.

CS – IGF-1C является биосовместимым и способствует пролиферации клеток in vitro . (A) IGF-1C был привит на CS посредством реакции щелчка между азидом IGF-1C – N ₃ и алкином алкинил-CS.(B) Анализ FT-IR показывает характерные пики CS-IGF-1C и алкинил-CS. В спектре видны характерные пики при 3082 и 2102 см ^-1 для алкинильной группы. Кроме того, также показаны пики при 2831 и 1172 см ^-1 , связанные с метиленовыми и метильными группами и гидроксильной группой в привитом сегменте IGF-1C. (C) Оценка реологического профиля гидрогеля CS – IGF-1C при изменении температуры. (D) Сканирующая электронная микрофотография показывает морфологическую структуру лиофилизированного гидрогеля CS-IGF-1C.Вставка показывает гелеобразование гидрогеля. (E) Набор для подсчета клеток-8 показывает жизнеспособность ADSC в присутствии различных концентраций гидрогеля CS-IGF-1C в культуре in vitro . Данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего. (F) Анализ BLI показывает усиленную пролиферацию ADSC, культивируемых на планшетах, покрытых гидрогелем CS-IGF-1C. (G) Количественный анализ сигналов BLI. Активность сигнала выражается в фотонах / с на см ² на стерадиан (ср). Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0.05 по сравнению с непокрытием; ^# P <0,05 по сравнению с CS. (H) Анализ RT-PCR в реальном времени экспрессии связанных с пролиферацией генов ADSC, культивированных на гидрогеле CS-IGF-1C, покрытых гидрогелем CS или непокрытых планшетах в течение 1, 7 и 14 дней. Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с без покрытия; ^# P <0,05 по сравнению с CS. Все эксперименты проводили в трех повторностях.

Термочувствительный гидрогель CS — идеальный каркас для инъекций для доставки стволовых клеток. ²⁴ Реологические исследования были проведены для анализа гелеобразования гидрогеля CS – IGF-1C. Реологический профиль с изменениями температуры гидрогеля CS-IGF-1C (рис. 1C) был оценен и сравнен с таковым гидрогеля CS без иммобилизации IGF-1C (гидрогель CS) (дополнительный рисунок 1B). При повышении температуры с 10 ° C до 50 ° C как CS-IGF-1C, так и гидрогель CS показали очевидное увеличение модуля накопления (G ‘), что указывает на фазовый переход раствора в гель. Температура гелеобразования гидрогеля CS-IGF-1C составляла от 35 ° C до 36 ° C, аналогично температуре гидрогеля CS, что указывает на то, что гидрогель CS-IGF-1C подходит для преобразования in situ из жидкости в гидрогель в организме. температура.Морфологическую структуру лиофилизированного гидрогеля CS – IGF-1C наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Гидрогели показывают однородные и взаимосвязанные поры со средним размером пор около 50 мкм м (рис. 1D).

Биосовместимость гидрогеля CS – IGF-1C

В настоящем исследовании ADSC были выделены у трансгенных мышей, которые экспрессируют люциферазу светлячка (Fluc) и зеленый флуоресцентный белок (GFP) (дополнительный рисунок 2). Анализ пролиферации клеток показал, что оптимальная концентрация гидрогеля CS-IGF-1C составляла 3% (рис. 1E), а последующие эксперименты показали превосходную биосовместимость гидрогеля CS-IGF-1C (дополнительный рисунок 3).Биолюминесцентная визуализация (BLI) показала, что ADSCs увеличиваются быстрее при культивировании на планшетах, покрытых гидрогелем CS-IGF-1C, чем на планшетах без покрытия или покрытых CS (рис. 1, F и G). Кроме того, экспрессия связанных с пролиферацией генов IGF-1 , фактора роста гепатоцитов (HGF) и фактора роста эпителия (EGF) резко повышалась в ADSC, культивируемых на планшетах, покрытых гидрогелем CS-IGF-1C. по сравнению с таковым на CS-покрытых гидрогелем или непокрытых пластинах (рис. 1H).Более того, на фенотипические и мультидифференциальные свойства ADSC не влияли CS-IGF-1C или CS гидрогель в культуре in vitro (дополнительная фигура 4).

Цитопротективные эффекты гидрогеля CS-IGF-1C

Для исследования клеточных защитных эффектов гидрогеля CS-IGF-1C ADSC обрабатывали перекисью водорода (H ₂ O ₂ ) и определяли выживаемость клеток с помощью BLI. . H ₂ O ₂ лечение привело к дозозависимому снижению сигнала BLI.Когда клетки культивировали на планшетах, покрытых гидрогелем CS, выживаемость клеток значительно улучшалась, а гидрогель CS-IGF-1C дополнительно усиливал этот эффект (рис. 2, A и B). Чтобы определить путь, вовлеченный в это защитное действие, мы измерили экспрессию связанных с апоптозом генов в ADSC после обработки H ₂ O ₂ (100 мМ) в течение 2 часов. H ₂ O ₂ обработка увеличивала экспрессию генов апоптоза Bax , Bad , Caspase-3/9 , Fas и FasL в ADSC.Покрытие CS-гидрогелем заметно снижает экспрессию этих генов, которая в дальнейшем снижается в клетках обработкой CS-IGF-1C гидрогелем (рис. 2C).

CS – IGF-1C оказывает антиапоптотическое действие in vitro . (A) Выживание ADSC после воздействия H ₂ O ₂ было проанализировано с помощью BLI. ADSC культивировали на планшетах, покрытых гидрогелем CS-IGF-1C, покрытых гидрогелем или не покрытых CS, и подвергали воздействию H ₂ O ₂ . (B) Количественная оценка сигналов BLI показывает, что обработка H ₂ O ₂ приводит к дозозависимой апоптотической гибели клеток и что гидрогель CS-IGF-1C значительно улучшает выживаемость клеток.Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с без покрытия; ^# P <0,05 по сравнению с CS. (C) Анализ RT-PCR в реальном времени экспрессии гена, связанного с апоптозом, ADSC после обработки 100 нМ H ₂ O ₂ в течение 2 часов. Клетки культивировали на планшетах, покрытых гидрогелем CS-IGF-1C, покрытых гидрогелем CS или не покрытых гидрогелем, в течение 1, 7 и 14 дней. Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с без покрытия; ^# P <0.05 против CS. Эксперименты проводили в трех экземплярах.

Улучшение приживления клеток

Чтобы оценить активность гидрогеля CS – IGF-1C по выживанию, мы выполнили анализ BLI для продольного отслеживания выживаемости ADSC в модели AKI. Наши данные BLI продемонстрировали надежные сигналы из области почек на 1-й день после внутрипочечной доставки ADSC во всех группах, что свидетельствует об успешной трансплантации ADSC. Однако в последующие дни группа ADSC испытала значительную гибель донорских клеток.Серийный BLI тех же животных продемонстрировал улучшение приживления клеток при нанесении CS-гидрогеля, а CS-IGF-1C гидрогель еще больше усилил этот эффект, предполагая, что CS-IGF-1C гидрогель может увеличивать выживаемость клеток и может обеспечивать способ увеличения терапевтического потенциала ADSC. (Рисунок 3, А и Б). Повышенное приживление клеток гидрогелем CS-IGF-1C было также подтверждено иммуногистологией (рис. 3, C и D). Более того, индекс пролиферации ADSC GFP ⁺ , доставленных с гидрогелем CS-IGF-1C, был значительно выше, чем с гидрогелем CS или PBS (рис. 3, E и F).Кроме того, мы провели иммунофлуоресценцию и окрашивание гематоксилином и эозином одного и того же среза почки, чтобы лучше наблюдать локализацию, распределение и приживление ADSC, встроенных в гидрогели. Клеточные скопления трансплантированных ADSC наблюдались в контексте почек в гидрогелях на 3-й день (рис. 3G). На 14 день можно было обнаружить миграцию клеток из гидрогеля (рис. 3H). Более того, гидрогель CS-IGF-1C может значительно улучшить выживаемость клеток и дополнительно способствовать миграции клеток.

Гидрогель CS – IGF-1C увеличивает выживаемость, пролиферацию и миграцию ADSC in vivo . (A) Судьбу ADSC после трансплантации отслеживали с помощью молекулярной визуализации. Изображения получены от репрезентативных животных, получавших только 1 × 10 ⁶ ADSC с CS гидрогелем или CS-IGF-1C гидрогелем. (B) Количественный анализ сигналов BLI демонстрирует, что выживаемость клеток была улучшена за счет применения гидрогеля CS и гидрогеля CS-IGF-1C во всех временных точках. Группа гидрогелей CS-IGF-1C показала значительно лучшую выживаемость клеток.Данные выражены как среднее ± SEM. (C) Типичные микрофотографии демонстрируют приживление ADSC (GFP, зеленый) в почках на 3-й и 14-й дни. Эпителиальные клетки проксимальных канальцев окрашивали агглютинином кулинарии хрусталика, меченным родамином (LCA, красный). (D) Данные количественного анализа показывают, что гидрогель CS улучшает приживление клеток, а гидрогель CS-IGF-1C еще больше усиливает этот эффект. Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с ADSC; ^# P <0,05 по сравнению с ADSC, котрансплантированными с CS гидрогелем (ADSC / CS).(E) Репрезентативные изображения показывают пролиферацию (Ki-67, красный) трансплантированных ADSC (GFP, зеленый) в пограничных областях через 3 дня после AKI. Окрашивание LCA (голубой), меченное DyLight 649, выполняли для выявления структуры почек. (F) Количественная оценка индекса распространения ADSC. Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с ADSC; ^# P <0,05 по сравнению с ADSC / CS. (G) Иммунофлуоресценция и окрашивание гематоксилином и эозином одного и того же 3-дневного среза почки, показывающее локализацию, распределение и приживление ADSC, доставляемых гидрогелями CS или CS-IGF-1C.(H) Репрезентативные фотографии, показывающие миграцию ADSC на 14 день. Пунктирными линиями обозначена граница между местом инъекции и почечной тканью. Клетки контрастировали 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом для выявления ядра (синий). Эксперименты проводили в трех экземплярах. Масштабные линейки, 100 µ м. ADSC / CS – IGF-1C, котрансплантированные ADSC с гидрогелем CS – IGF-1C; HPF, поле большой мощности.

Усиление противовоспалительного действия

Было высказано предположение, что МСК играют решающую роль в регенерации тканей, модулируя воспаление. ²⁵ Чтобы определить противовоспалительные эффекты гидрогеля CS-IGF-1C, мы провели иммуноокрашивание CD68 и TNF- α для оценки инфильтрации макрофагов и окислительного стресса. Рекрутинг макрофагов и экспрессия TNF-α были значительно снижены в группе котрансплантации гидрогеля ADSC и CS-IGF-1C по сравнению с другими группами (рис. 4, A – D). Аналогичные результаты были получены при измерении экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов с использованием количественного анализа RT-PCR (дополнительные рисунки 5, A и B).Эти данные показали, что противовоспалительное действие ADSC может быть усилено гидрогелем CS-IGF-1C.

CS – IGF-1C усиливает противовоспалительное действие ADSC. (A) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания CD68 (красный) показывают рекрутирование макрофагов на 3 день после AKI. Эпителиальные клетки проксимальных канальцев окрашивали меченным флуоресцеином агглютинином кулинарии хрусталика (LCA; зеленый). (B) Количественный анализ инфильтрированных CD68-положительных клеток. Данные выражены как среднее ± SEM.(C) Репрезентативные изображения показывают иммуноокрашивание TNF- α (красный), обнаруженное в эпителиальных клетках проксимальных канальцев (меченый флуоресцеином LCA, зеленый) на 3 день. (D) Количественная оценка окрашивания TNF- α . Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с PBS; ^# P <0,05 по сравнению с ADSC; ^$ P <0,05 по сравнению с ADSC, котрансплантированными с CS гидрогелем (ADSC / CS). Число положительных клеток подсчитывал слепой исследователь в десяти случайно выбранных областях.Эксперименты проводили в трех экземплярах. Масштабные линейки, 100 µ м. ADSC / CS – IGF-1C, котрансплантация ADSC с гидрогелем CS – IGF-1C.

Гидрогель CS – IGF-1C усиливает проангиогенную активность ADSC

Терапевтический эффект МСК в основном объясняется их паракринным действием и экспрессией проангиогенных цитокинов. ²⁶ Чтобы исследовать, может ли гидрогель CS-IGF-1C усиливать проангиогенную активность ADSC, ADSC от нормальных мышей трансплантировали трансгенным мышам VEGFR2-luc .Вызванная ADSC экспрессия рецептора 2 VEGF (VEGFR2) в качестве считывающего устройства для ангиогенеза может отслеживаться с помощью BLI в режиме реального времени. ²⁷ BLI-сигнал был обнаружен во всех группах, кроме фиктивных, и самый сильный сигнал был обнаружен в группе котрансплантации гидрогеля CS-IGF-1C и ADSC, что позволяет предположить, что пути VEGF / VEGFR2 были активированы и IGF-1C мог увеличить этот ангиогенный эффект. эффект (рис. 5, А и Б). Сигнал BLI, обнаруженный в группе PBS, указывает на то, что повреждение также может инициировать ангиогенез.Этот молекулярный паттерн также был отражен при гистологическом исследовании неоваскуляризации. Ангиогенез в местах инъекции гидрогеля, оцененный с помощью иммуногистологии, показал, что плотность микрососудов значительно повышалась при нанесении гидрогеля CS-IGF-1C через 14 дней, что согласуется с результатами BLI (рис. 5, C и D). Двойное окрашивание GFP и CD31 также выявило заметное повышение плотности микрососудов за счет иммобилизованного IGF-1C на 3 день (дополнительная фигура 6). Эти результаты предполагают, что гидрогель CS-IGF-1C может улучшать проангиогенные свойства ADSC в постишемической почке.

CS – IGF-1C усиливает проангиогенные эффекты ADSC. (A) In vivo BLI, отслеживающий пространственно-временную кинетику экспрессии Vegfr2-luc после трансплантации ADSC в модели мыши с AKI. (B) Данные количественного анализа показывают, что индуцированный ADSC ангиогенез был улучшен за счет применения гидрогеля CS и гидрогеля CS-IGF-1C. Группа гидрогелей CS – IGF-1C показала лучшие ангиогенные эффекты по сравнению с другими группами. Данные выражены как среднее ± SEM. n = 5.* P <0,05 по сравнению с PBS; ^# P <0,05 по сравнению с ADSC; ^$ P <0,05 по сравнению с ADSC, котрансплантированными с CS гидрогелем (ADSC / CS). (C) Типичные изображения срезов почек, окрашенных на CD31 (зеленый), на 14 день. Шкала шкалы, 100 мкм мкм. (D) Количественный анализ показывает, что плотность капилляров была значительно выше в группе гидрогеля CS-IGF-1C по сравнению с другими группами. Число капиллярных сосудов подсчитывал слепой исследователь в десяти случайно выбранных областях.Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с PBS; ^# P <0,05 по сравнению с ADSC; (E) ОТ-ПЦР-анализ в реальном времени экспрессии ангиогенного фактора в ADSC, культивируемых на нормальных планшетах (контроль) и планшетах, покрытых гидрогелем CS и CS-IGF-1C. Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с без покрытия; ° P <0,05 по сравнению с CS. Все эксперименты проводили в трех повторностях. ADSC / CS – IGF-1C, котрансплантированные ADSC с гидрогелем CS – IGF-1C; стерадиан.

Чтобы получить представление о механизмах ADSC-индуцированного ангиогенеза, был проведен анализ ОТ-ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что гены, связанные с ангиогенезом Ang-1 , Ang-2 , VEGF-A , HIF-1α , PLGF , PDGF-BB , bFGF, и CCL5 были значительно усилены в группе гидрогеля CS-IGF-1C по сравнению с таковыми, культивировавшимися в нормальных условиях или в условиях, покрытых гидрогелем CS (рис. 5E). Эти результаты показывают, что гидрогель CS-IGF-1C может усиливать проангиогенную активность ADSC и дополнительно способствовать ангиогенезу почек после повреждения.

Клеточно-защитная роль гидрогеля CS-IGF-1C

Далее мы исследовали, может ли гидрогель CS-IGF-1C способствовать пролиферации клеток путем окрашивания ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Количество клеток PCNA ⁺ было заметно выше в почках, которым вводили ADSC, чем в почках, которым вводили PBS, и дополнительно увеличивалось при котрансплантации гидрогеля CS-IGF-1C на 3-й день (рис. 6, A и B). Согласованные результаты наблюдались, когда мы оценивали пролиферацию почечных клеток в местах инъекции гидрогеля через 28 дней (дополнительный рисунок 7).Кроме того, апоптоз почечных клеток после повреждения оценивали с помощью анализа мечения на конце дигоксигенин-дезоксиуридина, опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой. Трансплантация ADSC могла облегчить апоптоз клеток по сравнению с группой PBS на 3-й день. Этот эффект был дополнительно усилен нанесением гидрогеля CS и CS-IGF-1C (рис. 6, C и D). Эти результаты показывают, что терапевтический вклад гидрогеля CS-IGF-1C в восстановление почек включает стимуляцию регенерации эндогенных клеток и ингибирование апоптоза почечных клеток.

Обработка ADSC и гидрогеля CS – IGF-1C ускоряет восстановление почек. (A) Репрезентативные изображения показывают иммуноокрашивание PCNA (красный), обнаруженное в эпителиальных клетках проксимальных канальцев (флюоресцеин-меченный агглютинин кулинарии хрусталика [LCA], зеленый) через 3 дня после повреждения. (B) Количественная оценка PCNA-положительных клеток. Данные выражены как среднее ± SEM. n = 5. (C) Типичные изображения терминального дезоксинуклеотидилтрансфераз-опосредованного дигоксигенин-дезоксиуридинового мечения ник-конца (TUNEL) окрашивания (зеленый) в эпителиальных клетках проксимальных канальцев (LCA, меченные родамином, красный) на 3 день.(D) Количественная оценка анализа TUNEL. Данные выражены как среднее ± SEM. n = 5. Ядра контрастировали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (синий). (E) Типичные изображения срезов почек, окрашенных периодической кислотой по Шиффу, на 3 день. Наблюдается массивный некроз проксимальных канальцев с гиалиновым слепком (звездочки), а котрансплантация ADSC и гидрогеля CS-IGF-1C показывает почти полную профилактику гистопатологических изменений после ишемического / реперфузионного повреждения. Количественная гистологическая оценка (F) образования гиалиновой повязки и (G) канальцевого некроза.Данные выражены как среднее ± SEM. n = 5. (H) уровни мочевины и (I) сывороточного креатинина были измерены в различные моменты времени после тяжелой ОПП (односторонняя ишемия / реперфузия и контралатеральная нефрэктомия). Данные выражены как среднее ± SEM n = 10 на 2, 4, 7 и 10 дни; n = 8 на 14 день; n = 6 на 28 день. * P <0,05 по сравнению с PBS; ^# P <0,05 по сравнению с ADSC; ^$ P <0,05 по сравнению с ADSC, котрансплантированными с CS гидрогелем (ADSC / CS).Масштабные линейки, 100 µ м. ADSC / CS – IGF-1C, котрансплантированные ADSC с гидрогелем CS – IGF-1C; HPF, поле большой мощности.

Восстановление функции почек после AKI

Для исследования гистологических изменений, вызванных ADSC и нанесением гидрогеля CS-IGF-1C, было проведено световое микроскопическое исследование почек путем периодического окрашивания по Шиффу на 3-й день. Массивный некроз канальцевых клеток и Образование гиалинового слепка наблюдалось в проксимальных канальцах почек мышей в контрольной группе PBS, что было в некоторой степени облегчено трансплантацией ADSC.Котрансплантация ADSC и гидрогеля CS – IGF-1C показала, что некротические канальцы и гиалиновые цилиндры были значительно уменьшены по сравнению с котрансплантацией ADSC и CS гидрогеля, что указывает на более выраженное ренопротекторное действие IGF-1C (рис. 6, E – G).

Чтобы выяснить, способствует ли CS-IGF-1C функциональному восстановлению, опосредованному ADSC, были исследованы АМК и креатинин сыворотки. После AKI у мышей наблюдалось заметное ухудшение функции почек, о чем свидетельствовали повышенные уровни BUN и креатинина сыворотки.Трансплантация ADSC могла значительно улучшить почечную функцию, и этот эффект был дополнительно усилен применением гидрогеля CS и CS-IGF-1C, что отражено более низким уровнем мочевины крови и креатинина сыворотки (рис. 6, H и I).

Фиброз почек является прямым следствием травмы и приводит к прогрессирующей потере функции почек, что в конечном итоге приводит к ТПН. ²⁸ Он характеризуется чрезмерным накоплением ECM, в основном состоящего из коллагена 4 и фибронектина. Окрашивание трихромом по Массону продемонстрировало значительное уменьшение площади фиброза в группе, получавшей котрансплантацию ADSC и CS-IGF-1C, по сравнению с другими группами (рис. 7, A и B).Срезы почек, окрашенные коллагеном типа 4, продемонстрировали результаты, аналогичные результатам для окрашивания трихромом по Массону (рис. 7, C и D). Кроме того, котрансплантация ADSC и CS-IGF-1C значительно снижает инфильтрацию миофибробластов и снижает экспрессию матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2) по сравнению с другими группами (дополнительная фигура 8). Кроме того, гистологическая картина была подтверждена экспрессией мРНК генов синтеза внеклеточного матрикса и генов, связанных с путем фиброза, на 2-м месяце. Повышенная экспрессия коллагена типа 1 α 1, TGF- β , генов фибронектина и MMP-9 в Группа PBS была значительно снижена при лечении CS гидрогелем или ADSC и в дальнейшем уменьшилась в группе котрансплантации гидрогеля CS-IGF-1C (рис. 7E).С другой стороны, введение ADSC с помощью гидрогеля CS-IGF-1C значительно увеличивало экспрессию антифибротических генов, включая костный морфогенетический белок-7, тканевый ингибитор металлопротеиназы-1 и -2 и E-кадгерин (эпителиальный маркер, отражающий тяжесть фиброза) (Рисунок 7F). Эти результаты предполагают, что гидрогель CS-IGF-1C способствует антифибротическому действию ADSC при ОПП. Следовательно, мы оценили безопасность введения ADSC с гидрогелями в долгосрочной перспективе.В почечной паренхиме животных, получавших какое-либо лечение, не наблюдалось эктопической дифференцировки (дополнительная фигура 9).

Обработка ADSC и гидрогеля CS – IGF-1C ослабляет почечный фиброз. (A) Типичные изображения срезов почек, окрашенных на трихром по Массону через 2 месяца после AKI. (B) Количественная оценка окрашивания по Массону. (C) Типичные изображения срезов почек, окрашенных коллагеном 4 через два месяца после AKI. (D) Количественная оценка окрашивания коллагена 4. n = 5.Были проанализированы десять случайно выбранных областей. Масштабные линейки, 100 µ м. (E и F) Анализ RT-PCR в реальном времени экспрессии связанного с фиброзом гена в почках через 2 месяца после AKI. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Данные выражены как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с PBS; ^# P <0,05 по сравнению с ADSC; ^$ P <0,05 по сравнению с ADSC, котрансплантированными с CS гидрогелем (ADSC / CS). Масштабные линейки, 100 µ м. ADSC / CS – IGF-1C, котрансплантированные ADSC с гидрогелем CS – IGF-1C; BMP-7, костный морфогенетический белок-7; Col1a1, коллаген типа 1 α 1; DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол; ТИМП-2, тканевой ингибитор металлопротеиназы-2.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы охарактеризовали инъекционный биомиметический каркас, полученный иммобилизацией IGF-1C на гидрогеле CS в качестве системы-носителя для терапевтических средств на основе ADSC. CS-IGF-1C оказывает пропролиферативное, антиапоптотическое и проангиогенное действие на культивируемые ADSC. При трансплантации в ишемическую почку гидрогель CS-IGF-1C может защищать доставленные ADSC и дополнительно способствовать функциональному и структурному восстановлению почки. Эти преимущества могут быть отнесены к благоприятной нише, создаваемой взаимодействием клетки и гидрогеля, что приводит к увеличению выживаемости клеток, ингибированию воспалительных реакций, улучшению ангиогенеза и ослаблению фиброза (Рисунок 8).

Схематическая диаграмма отображает ренопротекторные эффекты ADSC и гидрогеля CS-IGF-1C. При котрансплантации в модель AKI гидрогель CS-IGF-1C может защищать доставленные ADSC, облегчать их паракринные и противовоспалительные эффекты и ингибировать синтез ECM в почках, что приводит к усилению ангиогенеза, регенерации и облегчению фиброза после повреждения почек. Следовательно, терапия гидрогелем CS-IGF-1C приводит к улучшенному функциональному и структурному восстановлению почек.

МСК являются привлекательными кандидатами для восстановления почек из-за их доступности, плюрипотентности и обширного потенциала. ²⁵ Было высказано предположение, что функциональные преимущества, наблюдаемые после трансплантации МСК, действуют паракринным образом и инициируют восстановление за счет иммуномодулирующего, пропролиферативного и антиапоптотического действия, а также стимуляции неоваскуляризации. ^29,30 Учитывая, что терапевтическая эффективность МСК связана с эффективностью приживления клеток, прямая внутрипочечная доставка представляет собой превосходную стратегию для максимального увеличения удержания и секреции клеток. Однако предыдущие исследования продемонстрировали нарушение выживаемости клеток, локально введенных в место повреждения, что потенциально связано с отсутствием взаимодействия между клеткой и матрицей, приводящего к аноикису во враждебном микросреде. ^4,9,10 Изучаются стратегии, направленные на продление выживаемости клеток с помощью биоматериалов для продления паракринной активации. ^8,9,11

Предыдущие исследования показали, что гидрогель на основе CS может регулировать пластичность клеток и усиливать сердечную, почечную и адипогенную дифференцировку ADSC. ^31–33 Факторы роста, компоненты микроокружения, также контролируют судьбу стволовых клеток посредством взаимодействия с клеткой и матрицей. Однако растворимые факторы роста, используемые в тканевой инженерии и регенерации, в конечном итоге будут диффундировать из каркаса и могут привести к вторичному воздействию на окружающие ткани и снижению местной функции. ¹⁵ Иммобилизация факторов роста путем связывания с матрицей для имитации ниши стволовых клеток может увеличить локальную концентрацию белков, а также снизить потребность в факторах роста для активации мощных функций, дополнительно предоставляя дополнительные сигналы для выживания и дифференцировки стволовых клеток. ^12,34 IGF-1, секретируемый МСК, увеличивал пролиферацию канальцевых клеток, и этот эффект был нарушен, когда IGF-1 был заблокирован с помощью специфического антитела. ²³ Первоначально считалось, что IGF-1C не имеет биологической функции, а скорее модулирует взаимодействие доменов A и B с инсулином и рецепторами IGF. ³⁵ Однако последующие исследования показали, что, как и его полноразмерные молекулы, этот 12-аминокислотный пептид способствует миграции эпителия in vitro и заживлению ран in vivo . ¹⁹ Эти данные проливают свет на использование домена C вместо полноразмерного белка в тканевых матрицах, поскольку он демонстрирует функциональность, аналогичную IGF-1, но сохраняет преимущества пептида. ¹⁷

Трансплантация стволовых клеток — перспективный вариант лечения ОПП.Однако эта терапия ограничена низкой задержкой клеток в ишемизированной ткани. ⁴ Отсутствие поддержки матрикса, ишемия и воспаление, вероятно, являются основной причиной гибели донорских клеток после трансплантации. ^8,36 В этом исследовании гидрогель CS и иммобилизованный пептид IGF-1C служат эффективной нишей для закрепления клеточного матрикса и активации нижестоящего сигнального пути ADSC. Вместе с усилением паракринных эффектов гидрогеля CS-IGF-1C, ADSC могут ингибировать воспалительные реакции, способствовать ангиогенезу, ослаблять фиброз и способствовать восстановлению функции почек.В моделях грызунов МСК замедляют прогрессирование ХЗП, подавляя фиброз. ^37–39 Наше исследование подтвердило этот эффект и дополнительно продемонстрировало, что терапия МСК гидрогелем CS-IGF-1C показала усиление ослабления фиброза за счет существенного ингибирования экспрессии ММП; это вовлечено в инициацию и прогрессирование почечного фиброза через эпителиально-мезенхимальный переход, а также активацию фибробластов. ⁴⁰ Соответственно, котрансплантация ADSC и гидрогеля CS-IGF-1C привела к подавлению экспрессии ряда профибротических генов, таких как TGF- β , коллаген 1 типа α 1 и фибронектин, в дополнение к увеличению экспрессии. антифибротических генов после ОПП.

Успешное клиническое применение регенеративной терапии на основе трансплантации стволовых клеток в будущем требует неинвазивных методов визуализации для мониторинга судьбы и тканевого распределения трансплантированных клеток. ^10,41,42 BLI показал, что выживаемость трансплантированных ADSC может быть значительно увеличена путем нанесения гидрогеля CS-IGF-1C. Помимо мониторинга выживаемости клеток, молекулярная визуализация также использовалась для визуализации в реальном времени экспрессии VEGFR2 in vivo , что обеспечивает прямые доказательства раскрытия терапевтического механизма ангиогенеза. ⁴² ADSC с обработкой CS гидрогелем приводили к умеренному усилению ангиогенеза после ишемии, которое было улучшено модификацией пептида CS-IGF-1C. Это усиление ангиогенного ответа может быть результатом пролонгированного высвобождения цитокинов при нанесении гидрогеля IGF-1C, как было ранее задокументировано. ^31,43

Таким образом, мы разработали и охарактеризовали систему на основе биоактивного гидрогеля для внутрипочечной доставки ADSC для лечения ишемической ОПП. Ковалентная иммобилизация пептида IGF-1C на гидрогеле CS обеспечивает искусственную нишу для ADSC и способствует закреплению клеточного матрикса и регуляции пролиферации клеток и воспаления при регенерации почек после AKI.Этот гидрогель может увеличить выживаемость ADSC, как показал BLI, и существенно улучшить функцию почек. Насколько нам известно, это первое исследование иммобилизации пептида IGF-1C в матрице для терапии стволовыми клетками. Доставка пептидов, которые имитируют биоактивность факторов роста путем ковалентного связывания с матриксом, является привлекательной стратегией для безопасной и эффективной регенерации, опосредованной стволовыми клетками.

Краткие методы

Полные методы представлены в дополнительном материале.

Получение гидрогеля CS – IGF-1C

Как показано на рисунке 1A, IGF-1C был привит на CS щелочной реакцией между азидом IGF-1C – N ₃ и алкином алкинилзамещенного CS (алкинил -CS).Вкратце, IGF-1C, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности GYGSSSRRAPQT (дополнительный рисунок 1A), был синтезирован с использованием ручной твердофазной химии Fmoc – аминокислоты. ^{44 ​​} Путем использования химии конденсации 6-азидогексановая кислота (Alfa Aesar, Ward Hill, MA) была затем связана с IGF-1C на N-конце с получением IGF-1C – N ₃ (N ₃ –GYGSSSRRAPQT). Параллельно был синтезирован алкинил-CS конденсацией CS (M = 200000; Jinke, Китай) с 4-пентиновой кислотой (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури) согласно предыдущему отчету. ⁴⁵ CS – IGF-1C, продукт реакции щелчка между IGF-1C – N ₃ и алкинил-CS, диализовали против деионизированной воды в течение 3 дней, а затем лиофилизировали.

Термочувствительный гидрогель CS с иммобилизованным IGF-1C (гидрогель CS-IGF-1C) был приготовлен, как сообщалось ранее. ⁴⁶ Вкратце, ледяной раствор β -глицерофосфата ( β -GP) (2,29 M) добавляли к раствору CS-IGF-1C (3 мас. / Об.%) По каплям при перемешивании в ледяная баня около 0.5 часов. Смешанный раствор переносили в инкубатор при 37 ° C для гелеобразования. Конечная концентрация β -GP в смешанном растворе составляла 0,23 М, а значение pH диализованного раствора CS / β -GP составляло 7,2. Гидрогель CS без иммобилизации IGF-1C был приготовлен по тому же протоколу.

Характеристика гидрогеля CS – IGF-1C

Химическая структура CS и CS – IGF-1C была охарактеризована с использованием метода FT-IR, как описано в другом месте. ⁴⁷ Спектр пропускания FT-IR в диапазоне длин волн от 4000 до 500 см ^-1 был получен с использованием спектрометра FT-IR (спектрометр FTS-6000; Bio-Rad, Hercules, CA).

Реологические измерения выполняли на 25-миллиметровом реометре с параллельными пластинами (TA Instruments, New Castle, DE). ⁴⁸ Реологические свойства образцов измеряли в диапазоне температур от 10 ° C до 50 ° C при постоянной скорости нагрева 1 ° C / мин. Изменения модуля упругости (накопления) (G ′) и модуля вязкости (потерь) (G ′ ′) регистрировались как изменение температуры при фиксированной частоте 1 рад / с. Фазовое отставание ( δ ) использовали для определения температуры гелеобразования, при которой модуль упругости (G ‘) и модуль вязкости (G’ ‘) были эквивалентны.Кроме того, морфология гидрогеля CS-IGF-1C после лиофилизации была проанализирована с помощью сканирующей электронной микроскопии (Quanta 200; FEI, Брно, Чешская Республика).

Выделение и культивирование ADSC

Протоколы для животных были одобрены руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Университета Нанкай, которые соответствуют «Руководству по уходу и использованию лабораторных животных», опубликованному Национальными институтами здравоохранения США (восьмое издание , 2011). ADSC были получены от мышей FVB дикого типа или трансгенных мышей FVB-Fluc / GFP.Трансгенные мыши FVB конститутивно экспрессируют репортерный ген Fluc и GFP по всему телу. ⁸ Двойная экспрессия Fluc / GFP может использоваться для отслеживания ADSC с помощью BLI и гистологии, соответственно. ⁸ Вкратце, жировая ткань (перитонеальные и подкожные участки) измельчали ​​и расщепляли 0,075% коллагеназы типа 4 (Sigma-Aldrich) в течение 1 часа при 37 ° C. Нарушенную ткань фильтровали, и изолированные клетки промывали средой α -MEM (Gibco, Grand Island, NY) и засевали культуральной средой, которая состояла из 80% α -MEM, 20% FBS (Gibco), и 5000 Ед / мл пенициллин / стрептомицин (Gibco).

Биосовместимость гидрогеля CS-IGF-1C

Для определения оптимальной концентрации гидрогеля CS-IGF-1C для пролиферации ADSC использовали набор для подсчета клеток-8 (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD). Для исследования биосовместимости гидрогеля CS-IGF-1C 96-луночные планшеты покрывали гидрогелем CS или CS-IGF-1C и добавляли 1 × 10 ³ ADSC на лунку. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием набора для анализа живых / мертвых клеток (Invitrogen, Carlsbad, CA). Жизнеспособность клеток рассчитывали и нормализовали к исходной жизнеспособности культуры.Для оценки пролиферации ADSC, культивированных в разных условиях, анализы BLI проводили одновременно.

Чтобы исследовать, может ли гидрогель CS-IGF-1C спасти H ₂ O ₂ — индуцированное повреждение, 96-луночные планшеты были покрыты гидрогелем CS или CS-IGF-1C. В общей сложности 1 × 10 ³ ADSC на лунку были засеяны и субкультивированы в течение 12 часов. H ₂ O ₂ добавляли в концентрациях 50, 100, 200 и 500 ммоль и инкубировали в течение 2 часов.BLI выполняли для оценки выживаемости клеток.

Трансплантация ADSC

Взрослых мышей FVB дикого типа (возраст 8–10 недель) были приобретены в Центре лабораторных животных Академии военно-медицинских наук (Пекин, Китай). Модель AKI, вызванная ишемией / реперфузией, была создана, как описано ранее. ⁵ Вкратце, животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата (330 мг / кг). После дорсального продольного разреза обнажили левую почку и зажали почечную ножку нетравматическим микрососудистым зажимом в течение 40 минут.Реперфузия была подтверждена визуально до закрытия разреза. После 15 минут реперфузии 1 × 10 ⁶ ADSC, стабильно экспрессирующих GFP-Fluc, вводили внутрипочечно в три участка коры левой почки в количестве 30 мкл л, суспендированных в PBS, гидрогеле CS или CS-IGF-1C. гидрогеля соответственно ( n = 15 для каждой группы). Инъекции PBS и CS гидрогеля служили контролем. Ложнооперированных животных подвергали той же хирургической процедуре без ишемии почек или трансплантации клеток / гидрогеля.

Для мониторинга in vivo в реальном времени ангиогенных эффектов гидрогеля CS-IGF-1C и выживших ADSC использовали трансгенных мышей VEGFR2-luc (Xenogen Corp., Hopkinto, MA) ( n = 10 для каждой группы). Мыши экспрессируют Fluc под промотором VEGFR2 ( VEGFR2-luc ). ²⁷ ADSC от мышей дикого типа были выделены для трансплантации.

Анализ функции почек

Для оценки функции почек мыши подверглись односторонней (слева) 40-минутной ишемии / реперфузии плюс контралатеральная нефрэктомия.В разные моменты времени после травмы были взяты образцы крови и сыворотка для оценки BUN и креатинина с использованием автоматического биохимического анализатора (Vitalab Selectra E).

BLI

Активность Fluc в пределах различного количества клеток была подтверждена ex vivo с использованием системы визуализации Xenogen IVIS Luminar, как описано в другом месте. ⁴ Renal BLI выполняли всем животным, как описано ранее. ^4,11 После внутрибрюшинной инъекции репортерного зонда d-люциферина (150 мг люциферина / кг массы тела) животных визуализировали в течение 1–10 минут с помощью системы визуализации IVIS Luminar.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния). Использовались двусторонний дисперсионный анализ с повторными измерениями и двусторонний тест t . Различия считались достоверными при значениях P <0,05.

Подробные методы анализа потенциала дифференцировки, гистологического анализа и количественной ОТ-ПЦР можно найти в дополнительных материалах.

Благодарности

Эта работа частично поддержана грантами Китайской национальной программы фундаментальных исследований (2011CB964903), Национального фонда естественных наук Китая (81522023, 81220108015, 81371620, 81371699 и 81320108014), Тяньцзиньского фонда естественных наук (14JC35CZD) и Программа для ученых Чанцзяна и инновационной исследовательской группы в университете (IRT13023).

• Авторские права © 2016 Американского общества нефрологов

Thy1-maSN и экспрессия трансгена у мышей дикого типа. (A) Схематическая диаграмма …

Контекст 1

… были получены трансгенные линии мышей C57BL / 6, которые экспрессируют различные уровни трансгена Thy1-мыши aSN (maSN) (рис. 1A). Две линии 1S14 и 1S16 имели сопоставимые низкие уровни, в то время как третья линия 1S13 экспрессировала уровни мРНК трансгена (верхняя часть рисунка 1В) и белка (нижняя часть рисунка 1В), которые были в 6 раз выше эндогенного aSN у мышей дикого типа, как показано количественная оценка на Рисунке 1C….

Контекст 2

… были получены трансгенные линии мышей C57BL / 6, которые экспрессируют различные уровни трансгена Thy1-мыши aSN (maSN) (рис. 1A). Две линии 1S14 и 1S16 имели сопоставимые низкие уровни, в то время как третья линия 1S13 экспрессировала уровни мРНК трансгена (верхняя часть рисунка 1В) и белка (нижняя часть рисунка 1В), которые были в 6 раз выше эндогенного aSN у мышей дикого типа, как показано количественная оценка на Рисунке 1C. Уровни мРНК трансгена в линии мышей 1S13 были сопоставимы с уровнями в двух линиях, описанных ранее, экспрессирующих A53T fPD и форму aSN дикого типа человека (haSN) [6]….

Контекст 3

… были получены трансгенные линии мышей C57BL / 6, которые экспрессируют различные уровни трансгена Thy1-мыши aSN (maSN) (рис. 1A). Две линии 1S14 и 1S16 имели сопоставимые низкие уровни, в то время как третья линия 1S13 экспрессировала уровни мРНК трансгена (верхняя часть рисунка 1В) и белка (нижняя часть рисунка 1В), которые были в 6 раз выше эндогенного aSN у мышей дикого типа, как показано количественная оценка на Рисунке 1C. Уровни мРНК трансгена в линии мышей 1S13 были сопоставимы с уровнями в двух линиях, описанных ранее, экспрессирующих A53T fPD и форму aSN дикого типа человека (haSN) [6]….

Контекст 4

… к линиям мышей Thy1-haSN [6], экспрессия мРНК трансгена Thy1-maSN и белка maSN в мозге мышей Thy1-maSN была широко распространена. Это иллюстрируется гибридизацией in situ (рис. 1D) и иммуногистохимическим анализом белка aSN (рис. 1E) в сагиттальных срезах мозга с малым увеличением Thy1-maSN (мозг мышей с нокаутом aSN (KO) служил в качестве отрицательного контроля). Общий паттерн экспрессии трансгена в Thy1-maSN также был очень похож на те, о которых сообщалось для двух линий, экспрессирующих haSN под контролем регуляторных последовательностей Thy1 [6]….

Контекст 5

… к линиям мышей Thy1-haSN [6], экспрессия мРНК трансгена Thy1-maSN и белка maSN в мозге мышей Thy1-maSN была широко распространена. Это иллюстрируется гибридизацией in situ (рис. 1D) и иммуногистохимическим анализом белка aSN (рис. 1E) в сагиттальных срезах мозга с малым увеличением Thy1-maSN (мозг мышей с нокаутом aSN (KO) служил в качестве отрицательного контроля). Общий паттерн экспрессии трансгена в Thy1-maSN также был очень похож на те, о которых сообщалось для двух линий, экспрессирующих haSN под контролем регуляторных последовательностей Thy1 [6]….

Context 6

… общий паттерн экспрессии трансгена в Thy1-maSN также был очень похож на описанный для двух линий, экспрессирующих haSN под контролем регуляторных последовательностей Thy1 [6]. Интересно, что у мышей Thy1-maSN не было явной потери веса до 6-месячного возраста (рисунок 1G), в отличие от мышей, сверхэкспрессирующих haSN с ранним началом потери веса (рисунок S1A). Только в возрасте 6-7 месяцев мыши Thy1-maSN перестали набирать вес и, кроме того, у них начинались серьезные двигательные нарушения….

Контекст 7

… общий паттерн экспрессии трансгена в Thy1-maSN также был очень похож на описанный для двух линий, экспрессирующих haSN под контролем регуляторных последовательностей Thy1 [6]. Интересно, что у мышей Thy1-maSN не было явной потери веса до 6-месячного возраста (рисунок 1G), в отличие от мышей, сверхэкспрессирующих haSN с ранним началом потери веса (рисунок S1A). Только в возрасте 6-7 месяцев мыши Thy1-maSN перестали набирать вес и, кроме того, у них начинались серьезные двигательные нарушения….

Контекст 8

… примерно до 6-7-месячного возраста мыши Thy1-maSN перестали набирать вес и, кроме того, начинали демонстрировать серьезный двигательный дефицит. Это снова резко контрастирует с мышами Thy1-haSN, у которых обнаружены ранние нарушения двигательной активности (рисунок S1 и [6]). Кроме того, мы наблюдали повышенную смертность мышей Thy1-maSN по сравнению с контрольными однопометниками дикого типа (wt) (рис. 1H). …

Контекст 9

… снова резко контрастирует с мышами Thy1-haSN, у которых обнаружены ранние нарушения двигательной активности (рис. S1 и [6]).Кроме того, мы наблюдали повышенную смертность мышей Thy1-maSN по сравнению с контрольными однопометниками дикого типа (wt) (рис. 1H). …

Контекст 10

… был укреплен с помощью приподнятого крестообразного лабиринта (рис. 2G). Примечательно, что у мышей Thy1-maSN обнаруживалось позднее начало и гораздо менее выраженное моторное нарушение, чем у трансгенных мышей, экспрессирующих трансген haSN, с ранним началом (уже в возрасте 5 недель) и устойчивым снижением моторного контроля (рисунок S1 и [6]). …

Контекст 11

… к более ранним наблюдениям у мышей, экспрессирующих формы haSN [6], мы обнаружили, что maSN экспрессируется во многих нейронах конечного мозга, гиппокампа, ствола мозга, ядер мозжечка и спинного мозга (рис. 1E). Экспрессия maSN в гиппокампе показала усиление перикариального и нейритного иммуноокрашивания для ядер aSN и мозжечка соответственно (рис. S2). …

аминокислот Asn — Международный журнал компьютерных технологий и …

  переключатель #  показать ip bgp 11.0.0.2/32 
Информация о таблице маршрутизации BGP для VRF по умолчанию
Идентификатор маршрутизатора 3.3.3.3, местная АС №1
Запись в таблице маршрутизации BGP для 11.0.0.2/32
Пути: 1 доступно
 Местный
 1.1.1.1 метки [111] из 100.100.100.1 (100.100.100.1)
 IGP источника, метрика 0, localpref 100, метрика IGP 40, вес 0, получено
21:07:07 назад, валидный, внешний, не установлен
 Rx SAFI: Этикетки
 Подходящий туннельный RIB  

  переключатель #  показать трубу ребра туннеля 
 Тип туннеля конечной точки Индекс (а) MetricMetric2 Preference Preference2
----------- ------------ --------- ------- ------- ---- ------------------
1.1.1.1 / 32IS-IS SR IPv4 5 40 0 ​​115 0

коммутатор #  показывает туннель с меткой bgp-одноадресной рассылки 
IndexEndpoint Nexthop / Tunnel Метки интерфейса индексов Вклад метрики
------------- -------------------- --------- ------ - ---------- ------
 1 11.0.0.2/32IS-IS SR IPv4 (5) - [111] Да 0

Метрика 2 Pref Pref 2
-------- ---- ------
 100 2000

коммутатор #  показывает туннель сегментной маршрутизации ISIS 
Индекс конечной точки
--------------------------------------------
5 1.1.1.1/326.6.6.6 Ethernet 5 [
1]
  

  переключатель #  показать маршрут mpls lfib 
Таблица пересылки MPLS (метка [метрика] Vias) - 20 маршрутов
Разрешение следующего перехода MPLS разрешает маршрут по умолчанию: False
Коды типов переходов:
 M - Mpls Via, P - Pseudowire Via,
 I - IP Lookup Via, V - Vlan Via,
 VA - EVPN Vlan Aware Via, ES - EVPN Ethernet-сегмент,
 VF - EVPN Vlan Flood Via, AF - EVPN Vlan Aware Flood Via,
 NG - Nexthop Group Via
Исходные коды:
 S - статический маршрут MPLS, B2 - BGP L2 EVPN,
 B3 - BGP L3 VPN, R - RSVP,
 P - псевдопровод, L - LDP,
 IP - сегмент префикса IS-IS SR, IA - сегмент смежности IS-IS SR,
 IL - сегмент IS-IS SR в LDP, LI - LDP в сегмент IS-IS SR,
 BL - BGP LU, ST - SR TE политика,
 DE - Отладка LFIB

S 111 [100]
 через М, 11.0.0.2, поп
полезная нагрузка ipv4, применить egress-acl
interface Ethernet 4  

  переключатель #  показать ip bgp 50.0.0.0/8 
Информация о таблице маршрутизации BGP для VRF по умолчанию
Идентификатор маршрутизатора 3.3.3.3, местная АС №1
Запись в таблице маршрутизации BGP для 50.0.0.0/8
Пути: 3 доступно
 Местный
 11.0.0.2 из 100.100.100.1 (100.100.100.1)
 Исходный IGP, метрика 0, localpref 200, метрика IGP 0, вес 0, получено 00:00:15
назад, действительный, внутренний, лучший
 Rx SAFI: одноадресная передача
 2 100
 1.1.1.1 из 1.1.1.1 (1.1.1.1)
 Исходный IGP, метрика 0, localpref 100, метрика IGP 0, вес 0, получено 00:04:49
назад, действительный, внутренний
 Rx SAFI: одноадресная передача
 2 200 300
 2.2.2.2 из 2.2.2.2 (2.2.2.2)
 Исходный IGP, метрика 0, localpref 100, метрика IGP 0, вес 0, получено 00:30:38
назад, действительный, внутренний
 Rx SAFI: Unicast  

  коммутатор #  show ip route 50.0.0.0/8 
VRF: по умолчанию
Коды: C - подключено, S - статично, K - ядро,
O - OSPF, IA - внутренняя область OSPF, E1 - внешний тип OSPF 1,
E2 - OSPF внешний тип 2, N1 - OSPF NSSA внешний тип 1,
N2 - OSPF NSSA внешний тип2, B I - iBGP, B E - eBGP,
R - RIP, I L1 - IS-IS уровень 1, I L2 - IS-IS уровень 2,
O3 - OSPFv3, A B - BGP Aggregate, A O - Обзор OSPF,
NG - Статический маршрут группы Nexthop, V - Служба управления VXLAN,
DH - DHCP-клиент установил маршрут по умолчанию, M - марсианский,
DP - Маршрут динамической политики

В I50.0.0.0 / 8 [200/0] через 11.0.0.2/32, индекс туннеля LU BGP 1
 через 6.6.6.6, Ethernet 5, этикетка  
1 111