Замена матрицы монитора — цена в Москве, сколько стоит ремонт матрицы монитора на YouDo

Чтобы ремонт матрицы ноутбука был выполнен качественно, закажите услуги специалиста на Юду. На сайте зарегистрированы высококвалифицированные мастера по ремонту компьютерной техники. Наши исполнители гарантируют:

• высокое качество обслуживания
• демократичные цены
• сжатые сроки выполнения заданий

Для устранения поломки жидкокристаллического экрана вам не придется тратить время на поиск сервисной мастерской и поездку туда. Исполнители Юду ремонтируют персональные компьютеры на дому у заказчиков. Выезд мастера для замены матрицы возможен в любой день недели, включая выходные.

Для вызова специалиста разместите на сайте Юду заявку на обслуживание. Исполнители из Москвы, готовые выполнить заказ, оперативно отреагируют на нее. Принимаются заявки на замену матриц ноутбуков всех марок и с различными диагоналями (от 10,1 до 21 дюйма).

Предоставляемые мастерами услуги

Исполнители Юду оказывают все виды услуг по обслуживанию компьютерной техники. По умеренной стоимости мастера производят замену:

• ЖК-матриц на ноутбуках
• ламп подсветки, инверторов, шлейфов матриц

Параллельно с устранением неисправности матрицы мастер может провести профилактическое обслуживание вашего ПК.

Порядок работы

Если есть возможность, мастер постарается починить компьютер без замены матрицы. Учитывая высокую стоимость детали, это позволит значительно сократить ваши затраты. Исполнителю Юду не удастся отремонтировать устройство, не меняя матрицу, если стекло на мониторе треснуло или деформировалось.

Ремонт матрицы специалист начнет с диагностики компьютера. Для этого у исполнителей Юду есть все необходимое оборудование и инструменты. Установив причину поломки, мастер наметит план восстановительных мероприятий и скажет, какие запчасти необходимы для того, чтобы починить ваш ноутбук.

Исполнители Юду бесплатно предоставляют помощь в поиске и закупке комплектующих частей для ремонта техники. Мастера подскажут, где по недорогой цене можно приобрести матрицы к ноутбукам, лампы подсветки ЖК-мониторов или другие детали.

Стоимость обслуживания

У исполнителей Юду самые выгодные цены на ремонт компьютерной техники. Обратившись к ним, вы сэкономите значительную сумму средств. Расценки у мастеров Юду на 10-30 % ниже, чем в крупных сервисных центрах в Москве и Московской области.

Стоимость обслуживания вашего компьютера будет рассчитана мастером, которому вы доверите задание, в индивидуальном порядке. Размер оплаты зависит от ряда факторов, среди которых:

• характер поломки
• характеристика матрицы (тип, размер и т. д.)
• общий объем выполняемой мастером работы
• срочность заказа и другие нюансы

При заказе ремонтных работ диагностика компьютеров производится специалистами бесплатно. Оплата обслуживания возможна в любой удобной для вас форме. Расценки на ремонт матрицы вы найдете в прайсах на youdo.com.

Ремонт и замена матриц (экранов) телевизоров

Ремонт матрицы (экрана) жк телевизора

Жидкокристаллическая (ЖК) матрица телевизора – самый дорогой элемент телевизора.

Естественно – поскольку это самый высокотехнологичный узел ТВ. При этом он является очень хрупким узлом телевизора. В этой статье рассмотрим основные неисправности жидкокристаллических или по-другому LCD матриц. При этом мы будем иметь в виду неисправности только самого стекла матрицы, поскольку восстановление именно стекол матриц является нашем основным профилем. Дефекты подсветки, такие как полное отсутствие свечения экрана, или его неравномерность не являются  темой статьи. Матрицей далее в статье будем называть цвето-формирующее стеклянное тело матрицы.

 

 

И основной причиной выхода матрицы из строя являются удары по ней или падение телевизора. В нашей практике даже был случай выхода из строя матрицы в результате удара головой попугая спорхнувшего со шкафа. Попугай жив, матрица – невосстановима. Это уже не говоря о летающих по комнате мягких детских игрушек со стеклянными глазиками. Вот настоящие враги ЖК телевизора. О футболе ил пробках от шампанского скромно умолчим.

…  При этой неисправности восстановление матрицы невозможно и мы можем предложить вам ее замену.

 

 

Следующей причиной неисправности матрицы —  является обычно заводской брак. Проявления этой поломки настолько разнообразны, и имеют  большое количество вариаций  от матрицы к матрице, что их будет трудно описать в этой статье. Основные – это вертикальные полоски или столбы на изображении, пропадание изображения или его части, специфические эффекты, такие как «торможение», «замерзание» изображения, появление засвеченных сторон на изображении, плавно переходящих в нормальное изображение, и прочие. Это вызвано неисправными чипами, интегрированными в стекло матрицы посредством гибких шлейфов (гибких печатных плат). Эта неисправность может быть устранена в нашей сервисной лаборатории. При этом нужно заменить один или более гибкий шлейф, интегрированный в стекло матрицы. Делается это при помощи специального оборудования и материалов.

 

 

Еще одной неисправностью LCD матрицы телевизора являются цветные пятна совершенно разных форм, круглых, неправильной формы.   Обычно это вызвано дефектом или разрушением стекла или поляризационной пленки.  Это происходит как в результате нарушений условий эксплуатации, или хранения матрицы так и по причине нарушений технологического процесса при производстве. В этих случаях возможна только замена матрицы, ремонт ее невозможен.

 

 

В крайне редких случаях все же приходится сталкиваться со случаями неудачной попытки отремонтировать матрицу «поднабравшись» опыта на форумах умельцев на все руки, или горе-мастерами. Здесь мы видим порванные гибкие шлейфы, треснувший край стекла матрицы. Все эти попытки, если и имеют успех, то очень нестабильный, краткий, и, очень часто, приводящий к летальному исходу самой матрицы. Дело в том, что ремонт матрицы жк – помимо самого восстановления, еще включает корректную сборку и разборку и много других операций, и если вам даже удалось что-то исправить, не всегда получится ее правильно собрать. Одно неверное движение – и матрица расколота! Она чрезвычайно хрупка.

Особенно матрица размеров более 32  дюймов.

 

 

Жидкокристаллическая матрица телевизора – чрезвычайно уязвимый элемент. Особенно учитывая то, что ее конструкция это 2  полумиллиметровых  в толщину, склеенных между собой стекла, при размере более 82 см в диагонали  — это, наверное, самое хрупкое создание из стекла. А элементы матрицы, помимо стекла, также, чрезвычайно легко выводятся из строя.  Это однозначно требует квалифицированного подхода в ремонте матриц, а также наличия необходимого оборудования и приспособлений для осуществления ремонта. В нашем распоряжении есть все необходимое для ремонта, тестирования жидкокристаллических или  LCD матриц. А самое главное – большой опыт, накопленный за годы ремонта матриц. Настоятельно не рекомендуем пытаться самостоятельно ремонтировать матрицу, так как это может привести к потере ее рекреационных свойств. Если матрица Вашего аппарата не подлежит восстановлению, мы произведем замену жк матрицы телевизора.

«Ремонт матрицы» телевизора/монитора

В процессе написания одного из обзоров, про использование китайской безделушки «а ля Ambilight«, умерла матрица моего телевизора.
Умерла не совсем- появились полосы по экрану.
Восстановлению данный дефект практически не подлежит (сложно и далеко не на любом ТВ возможно). В мастерской Вам наверняка предложат замену матрицы (что очень недешево), ну а смотреть с полосами очень неприятно и раздражает.
Однако имеется относительно несложный вариант «ремонта» подобной неисправности 🙂

На самом деле «ремонтом» это называть не совсем правильно (поэтому в кавычках), но продлить срок службы поврежденной матрице вполне реально — тем более, что дефект возможно убрать практически полностью!
Любопытно, но об этом варианте «лечения» не знали даже мои знакомые «любители- ремонтники» телевизоров и пр. электроники, поэтому решил написать небольшой обзор — вдруг еще кому окажется полезным? 🙂

Мне, например, уже пригодилось! 😉

Для описываемого «ремонта» практически не нужны специальные знания, не будем вникать в «дебри» — нет необходимости, обойдемся лишь несколькими популярными терминами и фразами, для общего понимания того, что мы будем делать.
Нам не понадобятся специфические инструменты (включая даже паяльник и тестер!), но потребуется некоторая аккуратность и относительно «прямые руки».
Весь ремонт (у меня) занял от силы полчаса, и то, основное время было потрачено на кручение винтиков для разборки/сборки телевизора, а вернее его задней крышки.

Вот так выглядел мой экран после появления дефекта!
На самом деле имеются вариации проявления подобной неисправности — разного вида полосы, затемнения части экрана и т.п.

Так стал выглядеть после «ремонта» — как говорится, почувствуйте разницу!
Практически идеально, а те искажения, которые Вы возможно видите на фото, это явление интерференции (если я не ошибаюсь в названии физического явления), и они почти исчезнут, если кликнуть для просмотра полной версии изображения

Положительный эффект от подобного «лечения» я (как минимум) наблюдал на паре телевизоров от LG и одного Самсунга- так что попробовать однозначно стОит.

Начнем!? 😉
Сразу поясню: Мы не будем вносить никаких изменений в конструкцию и схему, которые могут нанести дополнительный вред остальной схеме телевизора!

Надо однако понимать, что никто не застрахован от собственной неосторожности! Если Вы случайно упустите «кирпич» на экран или экран на кирпич, или произойдут другие форс-мажорные обстоятельства — я не виноват! 🙂
Все работы Вы производите на собственный страх и риск! 🙂
Кроме того, имейте в виду опасность поражения электрическим током — после снятия задней крышки телевизора, становятся доступными опасные напряжения!

В тоже время описанные далее действия не является «панацеей» — в конкретно Вашем случае может оказаться другой неисправность, или конструкция телевизора…
Главное, что «попытка не пытка» 😉 — и никаких необратимых действий Вы не производите!

Сначала нам надо отыскать плату тайминг контроллера (T-con) нашего ТВ.
Для этого НА ВЫКЛЮЧЕННОМ ОТ СЕТИ телевизоре снимаем заднюю крышку (откручиваем много-много винтиков).
При разборке желательно положить экраном на стол, застеленный мягким покрытием, чтобы не продавить/поцарапать экран.

T-con обычно можно определить по нескольким плоским шлейфам выходящим из него на матрицу, и входящему большому шлейфу от основной «материнской» платы. Шлейфы уходящие на матрицу в данном случае прикрыты, но мы и до них доберемся 😉

Вот она, необходимая нам плата. Чаще всего она имеет пару выходов шлейфов на матрицу (реже четыре).
По этим шлейфам (через дополнительные драйвера) происходит управление пикселами матрицы.

В процессе «ремонта» нам понадобится неоднократно отключать эти шлейфы. В общем-то ничего сложного нет, но для тех кто никогда с подобными не сталкивался лучше туда и не лезть необходимо подцепить, например ногтем, черную планку и потянуть вверх — она должна подняться вверх. После этого шлейф можно вытащить из разъема.


Для последующих действий понадобится полоска вырезанная из тонкой бумаги (я использовал кассовый чек).
Вначале используем полоску шириной около 5мм, длина произвольная (несколько см).
Накладываем ее на часть контактов разъема, прикрывая (изолируя) часть контактов, вставляем шлейф и защелкиваем замок. После чего включаем телевизор и смотрим результат.


В зависимости от того, какие именно контакты Вы прикрыли, изображение может иметь самые разнообразные искажения в виде вертикальных, горизонтальных полос или отсутствовать вовсе — не пугайтесь! 🙂

После каждой проверки выключаем ТВ, отщелкиваем замок разъема, вытаскиваем шлейф и сдвигаем полоску бумаги, и так до конца разъема, проходим по всем контактам… Добиваемся оптимального результата!

У меня на обоих ТВ «срабатывало» примерно в одних местах — это 8-10 контакт (если считать справа) на левом разъеме.
При чем, если слегка сдвинуть полоску влево или вправо результат не пропадал, но появлялось периодическое небольшое изменение яркости в правом углу экрана.
В идеале, необходимо изолировать как можно меньшее количество контактов (кроме того не всегда удается подобрать подходящий вариант с такой шириной полоски бумаги), поэтому следующим этапом используем более тонкую (или более широкую) полоску бумаги в найденном нами месте. Слегка сдвигаем ее до получения самого хорошего изображения.

После получения устраивающего Вас результата можно так и оставить кусочек бумаги в разъеме, или заклеить необходимые контакты, например тонким скотчем. Я просто бумажку оставил…

В данном случае удалось получить практически идеальный результат!
Белый экран без полос- наиболее видны они были именно на белом цвете. Некоторая неравномерность получается только на фото, в реальности все отлично!

Дополнительно -правый нижний угол, левый верхний угол


Тестовая картинка

«Дешево и вкусно!» 😉

Надо добавить, что данный способ практически идеально работает на «средних» размерах матриц (32-40). На более крупных, к одному из краев экрана возможно заметное падение быстродействия срабатывания пикселей, что может вызывать легкую размытость экрана или слабо выраженный эффект черезстрочности (что впрочем обычно уже не видно с небольшого расстояния).

немного подробнее, для тех, кому интересна суть проблемы и принцип ее решения.

Управление пикселами матрицы осуществляется специальными микросхемами — драйверами управления (TAB COF IC).
Эти микросхемы часто расположены на гибких шлейфах (так называемых «ушах») впаянных в стекло матрицы, либо на самой матрице, поэтому эта часть схемы мало пригодна для ремонта.
Выглядеть может например так

Проявление полос, это часто неисправность одного из драйверов, в нашем случае скорее всего он «пробит».

Средние и большие матрицы имеют удвоенное количество драйверов, они расположены с противоположных сторон экрана. По сути они включены параллельно, для уменьшения падения быстродействия срабатывания пикселей к концу строки, из-за увеличения сопротивления относительно длинных проводников.
В тоже время, для вполне нормальной работы не очень крупной матрицы, хватает драйверов и одной стороны — именно этим мы и пользуемся, при описанном выше, так называемом «ремонте» ;). Мы просто отключаем (изолируем) часть драйверов одной стороны, и матрица продолжает работать на исправных драйверах другой стороны.

Иногда, для этих же целей, ремонтники целиком отрывают эти так называемые «уши» на матрице- цель преследуется та же самая, но и не любая матрица имеет эти самые «ушки», да и добраться до них уже несколько сложнее…

Всем удачи и хорошего настроения! 😉

Матрица – принцип работы, проверка и восстановление

Основной элемент LCD-панели или попросту монитора – жидкокристаллическая матрица, представляющая собой законченный функциональный модуль с набором входных сигналов, определяемых его архитектурой. Поэтому все образцы этих устройств построены примерно одинаково, а их проверка и ремонт проводятся в виде стандартных процедур.

Устройство и порядок работы

Матрица представляет собой комбинацию большого числа жидких кристаллических ячеек, располагающихся системно. Характерным для нее является то, что положение каждого из этих элементов описывается двумя координатами: номерами строк и столбцов.

С другой стороны, в ее конструкции предусмотрены следующие модули (смотрите фото ниже):

• Рабочий интерфейс LVDS.
• Микроконтроллер TCON.
• Плата управления (ПУ) питающими напряжениями.
• Модуль задней подсветки (инвертор).

Обратите внимание: Последний компонент имеется не у всех моделей LCD-панелей.

Первый из модулей (интерфейс LVDS) обеспечивает высокую скорость приема данных и существенное снижение линейных помех. Благодаря этому узлу панель приобретает универсальные свойства, позволяющие эксплуатировать ее с любой управляющей платой, имеющей аналогичный интерфейс.

При его использовании информация на ЖК-панель передается в последовательном виде – поэтому в ее составе предусмотрен специальный чип, преобразующий данные в параллельный код. Он представляет собой интегральную микросхему, выполняющую функцию приемника. Далее данные в параллельном коде поступают на микросхему контроллера TCON.

Вторая составляющая матрицы обеспечивает выполнение следующих операций:

1. Управление синхронизацией и приемом данных.
2. Распределение ее по драйверам строк и столбцов.
3. Выдача управляющих сигналов на выход.

На выходном шлейфе контроллера формируется столько сигналов, сколько необходимо для управления транзисторами, встроенными в панель. Общее их количество определяется разрешением, которое поддерживается данным конкретным образцом матрицы. При разрешении 1600х1200, например, на экране будет 1200 строк и 4800 столбцов (1600х3).

Дополнительная информация: Умножение на 3 означает, что каждый цветной элемент формируется на базе трех располагающихся рядом точек.

В панелях большинства марок используется полосковая топология, называемая Stripe. Пример расположения точек на поверхности матрицы приводится на фото снизу.

Характерные неисправности

К числу основных проблем, чаще всего возникающих при эксплуатации матриц, следует отнести:

• Монитор не включается, а светодиод индикатора питания не светится.
• Слишком низкая или очень высокая яркость картинки.
• Изображение на экране мигает (все или только один край).
• Темный экран (индикатор питания горит).
• Экранная подсветка гаснет через какое-то время.
• Отсутствует один цвет.

Рассмотрим каждую из неисправностей более подробно.

В первом случае, возможно, вышел из строя внутренний источник питания, который можно попробовать отремонтировать. Однако специалисты советуют при наличии возможностей сразу заменить его новым изделием (сделать это можно, если он оформлен как отдельный модуль). В ситуации, когда источник входит в состав управляющей платы – придется полностью обновить этот узел. Причиной этой неполадки также могут быть:

• Выход из строя сетевого адаптера (в моделях, где он имеется).
• Неисправность кнопки включения.
• Неполадки в самой ПУ.

Для устранения этих нарушений сначала нужно проверить «подозрительную» деталь, модуль или плату с помощью тестера (на предмет наличия нужных напряжений и отсутствия обрывов в рабочих цепях). При обнаружении поврежденных узлов или элементов плату, адаптер или кнопку придется заменить.

При выявлении неисправности второго рода (изменился уровень яркости) причину следует искать в нарушениях в работе инвертора, лампочек задней подсветки или ПУ. После проверки импульсных напряжений на выходе инвертора и управляющей платы можно будет убедиться в их состоянии.

Важно! Для получения полной картины с управляющими сигналами удобнее всего воспользоваться цифровым осциллографом.

Если нужные импульсные напряжения на выходе этих узлов отсутствуют – потребуется заменить их исправными. При наличии всех сигналов можно попробовать обновить лампочки подсветки. В ряде моделей следует начинать с проверки соединительного шлейфа между инвертором и ПУ на предмет его целостности.

При мигающем экране неисправными могут быть инвертор или лампа задней подсветки. Для устранения этой неисправности придется проделать все те же операции, что и в предыдущем случае. При обнаружении нарушений в формировании импульсных сигналов или обрыва шлейфа – необходимо заметь эти элементы новыми изделиями. Неисправную лампочку подсветки также потребуется обновить.

При наличии опыта соответствующих работ можно попытаться отремонтировать инвертор своими руками. Однако в этом случае надеяться на положительный результат можно не всегда. Если экран потемнел и ни изменяет свое состояние (фото ниже) – нужно проверить преобразователь в плате ПУ или инвертор.

В первом случае следует убедиться с помощью тестера в наличии напряжений у всех стабилизаторов и при обнаружении нарушений заменить неисправный элемент новой деталью. При выявлении отклонений в работе инвертора проще всего заменить его рабочим аналогом.

Если экран выключается через неопределенное время – нарушение, скорее всего, кроется в срабатывании токовой защиты инвертора. Другой причиной может быть неисправность лампочки задней подсветки. Для решения вопроса в этом случае рекомендуется заменить оба узла.

В ситуации, когда отсутствует один из цветов в изображении – неисправность может скрываться в нарушении работы интерфейса или ПУ. Если их проверка подтвердила эти предположения – вышедшие из строя узлы следует заменить. В заключение отметим, что к самостоятельному ремонту матрицы монитора не следует приступать, если вы полностью не уверены в своих силах.

Ремонт ЖК матрицы телевизора своими руками

Жидкокристаллическая панель – это ключевая и наиболее дорогая составляющая любого телевизора. Для ремонта данного компонента при его поломке пользователь может обратиться в специализированную мастерскую или же полагаться на собственные силы. Выбрав второй вариант, владелец ТВ должен быть готов к ряду трудностей, которые неизбежно возникнут при выполнении данной процедуры. Облегчить весь процесс поможет наша подробная инструкция, где детально разобран ремонт ЖК матрицы телевизора.

Основные неполадки

Сразу же отметим, что в данном материале не мы не будем говорить о дефектах LED подсветки, как её мерцание, неравномерность, а также частичное либо полное отсутствие. При рассмотрении повреждений и неполадок речь будет идти только о самом стекле матрицы, где и формируется картинка. Для удобства мы разделили все дефекты на несколько разновидностей, к которым будут написаны советы по ремонту, если он возможен.

Физическое повреждение

В большинстве случаев жидкокристаллическая панель выходит из строя после ударов по экрану, падения устройства и других аналогичных факторов. В отличие от старых телевизоров, современные матрицы не так хорошо могут выдержать некоторые механические нагрузки. Даже бросок ребёнком мягкой игрушки со стеклянным глазом в экран телевизора может плачевно закончиться для последнего.

Если в вашем ТВ матрица поломалась под воздействием чрезмерного физического воздействия, тогда она восстановлению не подлежит и ЖК панель необходимо менять.

Искажение изображения

Не редкостью также является и заводской брак. Проявляться он может как сразу после покупки телевизора, так и спустя некоторое время пользования устройством. Данная поломка может быть настолько разнообразной, что её легко можно разбить сразу на несколько категорий:

1. вертикальные полосы на экране;
2. отсутствие картинки либо её части;
3. столбы на изображении;
4. «замирание» или «торможение» кадра;
5. засвеченные области на матрице, сменяющие своё положение;
6. искажение цветов и так далее.

Причин у данной неисправности может быть очень много. Обычно проблема кроется в гибких шлейфах, интегрированных в стекло матрицы, и управляющих чипах.

В большинстве случаев эту неисправность можно устранить при обращении в сервисный центр вашего производителя. Самостоятельно же пытаться исправить неполадку в новом телевизоре не следует, ведь вам откажут в гарантийном обслуживании. Более того, даже если дефект вызван именно заводским браком, что предполагает замену устройства на новое, вы также не сможете получить компенсацию после самостоятельного вмешательства.

Появление пятен на картинке

Ещё одной распространённой поломкой матрицы являются различные пятна овальной, округлой и любой произвольной формы. Появляются они из-за дефектов стекла матрицы либо по причине разрушенного поляризационного слоя.

 

Износ этих элементов может быть вызван не только производственным браком, но также нарушением правил транспортировки, норм хранения и даже требований к эксплуатации. Если на дисплее вашего телевизора появились такие пятна, то в этом случае единственное возможное решение – замена матрицы.

Неквалифицированное вмешательство

Хотя это не частая причина поломки дисплея, но о ней также следует упомянуть. Проблемы с матрицей также могут появиться после самостоятельного ремонта LED подсветки, экрана или других компонентов телевизора. В данном случае могут появиться порванные шлейфы, трещины в углах экрана, сколы и другие повреждения. Безусловно, ремонт ЖК матрицы телевизора можно выполнить и собственноручно, но для этого важно не только изучить вопрос, но также проявлять аккуратность. Помните, что починка любой техники также включает в себя грамотную разборку и сборку.

Разбор устройства и устранение проблемы

Очень важно процедуру разбора проводить очень аккуратно, чтобы не повредить другие компоненты устройства и не сделать ремонт телевизора непомерно дорогим. Особенно важно проявлять осторожность при извлечении самого экрана, ведь разрыв ведущего к нему шлейфа потребует, как и в случае с физическим разрушением, полного замена матрицы. Увы, но такой ремонт не всегда можно назвать выгодным решением, ведь с учётом его стоимости куда разумнее будет приобрести новую модель. Точная цена зависит от особенностей матрицы, наличия других дефектов, а также доступности нового экрана в продаже. Перед разбором телевизора нужно подготовить достаточно места на большом столе. Пространства должно быть минимум в 2.5-3 раза больше, чем габариты устройства. Это необходимо для удобного перекладывания разных элементов, как винты, платы, а также сама матрица. Также рекомендуется подстелить на место, где будут проводиться все процедуры, кусок картона или плотную мягкую ткань, которая защитит дисплей от царапин, сколов и других повреждений.

Затем телевизор кладётся на стол экраном вниз и по периметру корпуса откручиваются винты, удерживающие крышку. После этого она должна легко сниматься, но иногда также потребуется найти дополнительный фиксатор и выставить его в другую позицию. Выполнив данную процедуру, переверните телевизор и снимите переднюю раму с защёлок, что поможет вам получить доступ к матрице. В некоторых случаях получить доступ к внутренностям ТВ можно не с задней, а с передней части, что зависит от конструкции устройства.

Если вы случайно пролили на телевизор напиток (кофе, газировку и так далее), после чего на экране появились артефакты изображения, то иногда для восстановления работоспособности ТВ достаточно прочистить ведущие к дисплею шлейфы. В этом случае из инструментов, кроме отвёрток для разбора, вам понадобится только обычный ластик. Однако этот способ не поможет при физических повреждениях. Видео урок расскажет о правильной чистке шлейфа:

Замена матрицы

Когда корпус полностью снят, вы увидите перед собой металлический каркас матрицы, на котором закреплена вся электроника и соединённые с ней шлейфы.

Последние нужно очень аккуратно отсоединить, чтобы не допустить обрыва. Замена ЖК матрицы в телевизоре – хрупкий процесс. Затем откручиваются все винты, на которых закреплены материнская плата, блок питания и другие компоненты.

Сове! Чтобы не запутаться в последующей сборке можете предварительно сфотографировать размещение всех элементов телевизора.

После того, как все комплектующие модели отключены от матрицы, нужно распаковать новый экран и в обратном порядке закрепить на нём все платы, шлейфы и динамики. Как только все модули окажутся на своих местах, можно приступать к установке рамки и крышки на место, а также последующей проверке работоспособности устройства. На видео достаточно подробно рассказан данный процесс:

 

Вывод

Самостоятельный ремонт ЖК матрицы телевизора – это достаточно простая процедура, в которой в первую очередь важны не ранее полученные навыки, а осторожность и чёткое следование инструкциям. Если у вас есть минимальный опыт в разборке техники, то заменить экран в своём ТВ вы сможете без проблем. А вот для более серьёзных повреждений следует убедиться, что вам под силу устранить выявленную неполадку, а также удостовериться в целесообразности такого ремонта. Некоторые виды повреждений обойдутся владельцам телевизора в 60-80% стоимости новенькой модели, поэтому оцените экономическую выгоду. Если с финансовой точки зрения ремонт не кажется привлекательным решением, то следует отдать ТВ в мастерскую на запчасти, выручив за него немного денег.

Ремонт и замена матрицы на телевизора (ЖК, плазменного) в Санкт-Петербурге

Основная проблема многих плазменных и ЖК-телевизоров заключается в перегревании ячеек матрицы и, как результат, испарение люминофора. Поэтому и замена матрицы на телевизоре является мероприятием весьма распространенным и востребованным.

Матрица является основой плазменного и LCD-телевизора. Ее структура представляет собой множество стеклянных ячеек величиной в 0,5 мм, заполненных газом и покрытых люминофором, который способен преобразовывать энергию в свечение.

Как понять, что необходим ремонт матрицы телевизора

Перегревание ячеек матрицы является следствием выгорания, т.е. того явления, когда изображение на экране на протяжении длительного периода времени остается неизменным даже при переходе на другой канал. Помимо этого, многие пользователи сталкиваются с послесвечением, когда некоторая часть ячеек длительное время горит ярким светом.

Причинами, почему ремонт матрицы ЖК-телевизора может стать неизбежной мерой, зачастую служат и механические повреждения – удары, падения, царапины. Также на состояние матрицы нередко влияет попадание влаги.

Замена ЖК-матрицы телевизора – мероприятие достаточно сложное и недешевое. Как правило, стоимость такого ремонта составляет 30 — 70 % от стоимости нового телевизора, поэтому перед осуществлением любых ремонтных работ, необходимо произвести диагностику. Это позволит не только выявить точную причину поломки, но и понять целесообразность такого ремонта. Во многих случаях ремонт матрицы телевизора, цена которого зависит от модели, у профессиональных мастеров выходит дешевле покупки нового оборудования.

В Санкт-Петербурге Вы можете произвести замену матрицы телевизора Sharp, телевизора Вестел, LG и всех других марок в профессиональном ремонтном центре «Мастер Плюс». Своевременное обращение к специалисту помогает продлить срок службы телевизора.

Замена матрицы ноутбука, замена экрана или дисплея ноутбука. Ремонт разбитого экрана ноутбука. Сервисный центр ноутбуков. Fortis-service

Ремонт разбитого экрана ноутбука

Наш сервисный центр может заменить разбитый экран Вашего ноутбука за 20-30 минут, 90% всех матриц находится в наличие. 

Гарантия

Если Вас не устроили качества экрана, то возможен обмен-возврат втечение 14 дней. Гарантия на все матрицы от 3 месяцев.

Расскажем поподробней про экран на ноутбуке:

Матрицы для ноутбуков производят такие крупные корпорации, как AUO, Chi-Mei, Toshiba, Hannstar, Chunghwa, Samsung, LG Phillips, Sharp – это всемирно известные поставщики электронных деталей.

Самым сложным элементом в устройстве ноутбука является матрица, и в случае механических повреждений  возможна только замена матрицы, так как ремонту она не подлежит. LCD (Liquid Crystal Display) представляет собой жидкокристаллический монитор, который сделан из вещества, находящегося в жидком состоянии и обладающего оптическими свойствами. Именно жидкие кристаллы и составляютоснову матрицы.

В плане отказоустойчивости матрица – очень надежная деталь ноутбука, вывести ее из строя можно только путем механического повреждения, поэтому обращаться с ноутбуком следует очень бережно. Самые частые причины повреждения матрицы, после которых требуется замена дисплея ноутбука – это забывание различных предметов на клавиатуре,  падение ноутбука или попадание на матрицу значительного количества влаги. В подобных случаях лучше довериться квалифицированным специалистам, которые произведут замену матрицы, по всем параметрам соответствующую конфигурации вашего ноутбука. Ошибка, которую допускают многие пользователи, заключается в том, что при механическом повреждении дисплея они сразу же идут покупать новый ноутбук.

Помните – замена матрицы на ноутбуке ни в коей мере не отразится на качестве его работы!

Если Вы не нашли свою матрицу для ноутбука обратитесь по телефону+7 (495) 125-33-58, менеджер подскажит Вам, возможно ли ее заказать.

 

 

 

Как восстановить поврежденные волосы за 3 простых шага

В современном мире существует множество способов изменить прическу. Это весело! Это увлекательно! Это отличный способ выразить себя! Но у всех этих новых взглядов и новых цветов волос есть обратная сторона, а именно сильное повреждение волос. Значит ли это, что вам нужно перестать развлекаться с волосами? Точно нет! Благодаря некоторым революционным технологиям из Total Results теперь вы можете восстановить сломанные и сильно поврежденные волосы в три простых шага.Вот сенсация.

Все о волосах

Так объясняют научные и исследовательские специалисты Matrix. В основе поврежденных волос лежит состояние скрепления волос. Чтобы понять связь волос, полезно понять основную структуру волос. Волосы каждого человека состоят из белка. Белок состоит из аминокислот. Спирали этих аминокислот соединяются вместе, образуя цепи, которые называются полипептидными цепями. Полипептидные цепи образуют связи друг с другом, и именно эти связи скрепляют волосы.

Есть два типа облигаций. Водородные и солевые связи являются более слабыми из двух типов. Они также самые распространенные. Структуру этих связей можно изменить с помощью воды или тепла. Поэтому, когда вы накручиваете волосы на щипцы для завивки, водородные и солевые связи перестраиваются, чтобы временно сформировать ваши упругие локоны.

Дисульфидные или цистиновые связи — второй тип связей. Эти связи являются самыми прочными, и они определяют силу и эластичность ваших волос, то есть способность ваших волос возвращаться к нормальной форме после того, как они были растянуты.Эти связи можно разорвать с помощью химических процессов, таких как услуги по текстурированию, осветлитель или краска для волос. Этот тип разрыва связи является постоянным и приводит к трагическим переживаниям, таким как сломанные волосы и секущиеся кончики.

Три свидетельства того, что ваши волосы сильно повреждены

Так как же узнать, разорваны ли связи в волосах? Помимо очевидных визуальных проявлений сухости, вялости, безжизненности и ломкости волос, вот несколько конкретных индикаторов.

1. Шероховатость. Обрыв вдоль пряди волос делает волосы грубыми, а не мягкими и эластичными.Чтобы проверить шероховатость волос, поместите небольшую прядь между указательным и большим пальцами и проведите пальцами сверху вниз. Обратите внимание, заметно ли меняется текстура по мере того, как вы продвигаетесь к концам.
2. Хрупкость. Как упоминалось ранее, эластичность — это качество, которое позволяет волосам растягиваться, не теряя своей первоначальной формы. Нарушенные связи волос снижают эластичность, что приводит к вялым и безжизненным волосам. Чтобы проверить состояние эластичности волос, выделите один волос и осторожно потяните за него большим и указательным пальцами.Если волосы не принимают форму, ваша эластичность ухудшается.
3. Разрезные концы. Это довольно очевидно. Если вы внимательно посмотрите на свои концы, и они будут казаться ветвями, а не сплошными, они сломаны и расколоты.

3 шага к восстановлению сломанных связок волос и исправлению поврежденных волос

Прежде чем вы решите расстаться со своим колористом и вернуться к своему естественному, каштановому цвету волос, наберитесь духа. Что бы вы сказали, если бы вы могли восстановить эти разорванные узы не только дома, но и дома? Новая, состоящая из трех частей, система восстановления Total Results Re-Bond — это домашний режим для волос, сильно поврежденных из-за слишком большого количества химических обработок или из-за слишком сильной тепловой укладки.Вот как это работает:

1. Шаг первый — шампунь для повторного связывания. Созданный на основе лимонной кислоты, этот хелатирующий или глубоко очищающий шампунь удаляет вредные минералы, металлы и хлор, которые накапливаются на волосах, по сути «очищая холст» для последующих шагов. Наносишь на влажные волосы и смываешь.
2. Этап второй — предварительное приклеивание кондиционера. Этот предварительный кондиционер, насыщенный малеиновой кислотой, проникает глубоко в волокна волос, чтобы восстановить и укрепить эти ослабленные связи волос.Нанесите его после использования шампуня ReBond и оставьте на пять минут.
3. Шаг третий — кондиционер для повторного связывания. Благодаря высокой концентрации кислоты, называемой таурином, в этой формуле кондиционера, последний этап системы Re-Bond герметизирует и защищает каждую прядь изнутри, делая волосы сильными, здоровыми и как новые! Нанесите его на кондиционер и затем смойте.

Создатели Total Results обещают, что ReBond восстановит внутреннюю силу волос после повреждений от трех предыдущих осветительных / химических услуг, предлагая решение следующего поколения для переутомленных волос.Его можно чередовать с любой системой ухода и укладки Total Results (отличный выбор — Moisture Me Rich и So Long Damage ), и он является идеальным последующим средством домашнего ухода после процедуры Matrix Bond Ultim8 в салоне. защищает и восстанавливает связки волос во время окрашивания волос.

7 советов по сохранению здоровья заживших волос

После того, как ReBond вылечит ваши сломанные и чрезвычайно поврежденные волосы, профессионалы Matrix предложат советы, как сохранить ваши волосы в идеальном состоянии.

1. Остаться в обрез. Избегайте секущихся кончиков до того, как они появятся, — подстригайте волосы каждые два-три месяца, чтобы кончики оставались здоровыми.
2. Распутывай как босс. Энергичное расчесывание мокрых волос щеткой может привести к тому, что волосы будут ломаться и ломаться, если они запутаются. Воспользуйтесь гребешком с широкими зубьями или специальной щеткой для распутывания волос, начните с низа и аккуратно распутайте волосы по прядям.
3. Сухой сон. Сон на мокрых волосах приводит к их спутыванию, а спутывание — к ломкости.Так что, если вы принимаете вечерний душ, найдите время, чтобы высушить волосы перед сном. Или нанесите ночную маску для волос на влажные пряди и сверните волосы в пучок для защиты. Кроме того, подумайте о переходе на атласную наволочку, чтобы избежать трения и заеданий, которые могут еще больше повредить поврежденные волосы.
4. Ослабить. Плотные косы и хвостики плохо подходят для деликатных прядей волос. Так что держите прически, косички, пони и грязные булочки как можно свободнее. И всегда используйте свободные резинки для волос, гладкие заколки или резинки, чтобы закрепить волосы; никогда не резинки.
5. Шампунь Меньше. Растирание при мытье волос шампунем вызывает трение, которое может привести к ломкости нежных волос. Более того, чрезмерное мытье шампунем может лишить волосы натуральных масел, которые сделают их мягкими и эластичными. Так что сократите количество шампуня как можно больше. В дни, когда не бывает паразитов, освежите волосы и кожу головы с помощью сухого шампуня .
6. Клякса, не руб. Вытирать волосы насухо жестким полотенцем после мытья шампунем — еще один фактор стресса для ломких прядей.Профи рекомендуют заменить махровое полотенце на впитывающую ткань из микрофибры и аккуратно сжимать и промокать влажные волосы.
7. Beat the Heat. По возможности дайте волосам отдохнуть от фенов и щипцов для укладки. Нанесите крем для воздушной сушки и пусть ваша естественная текстура волос обретет форму!

Инъекционный гидрогель усиливает восстановление тканей после повреждения спинного мозга, способствуя ремоделированию внеклеточного матрикса

Синтез имидазол-поли (органофосфазен) гидрогеля

Все реакции проводили в атмосфере сухого азота с использованием стандартных методик линии Шленка.

Шаг 1: [NP (IleOEt) _1,45 (AEtOH) _0,14 (AMPEG750) _0,41 ] _n (Полимер I, EP)

IleOEt · HCl (23,81 г, 121,67 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (THF), содержащем триметиламин (TEA), медленно добавляли к поли (дихлорфосфазену) (10,00 г, 86,29 ммоль), растворенному в сухом THF. Реакционную смесь инкубировали на бане с сухим льдом в течение 12 часов и при комнатной температуре в течение 36 часов. AEtOH (1,56 г, 25,50 ммоль) и AMPEG750 (37.53 г, 50,04 ммоль) растворяли в сухом THF, включая TEA, и добавляли к смеси. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем при 40–50 ° C в течение 24 ч. К реакционной смеси добавляли AMPEG750 (18,76 г, 25,02 ммоль) в высушенном ТГФ и перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем при 40–50 ° C в течение 24 часов. Реакционную смесь фильтровали; фильтрат концентрировали и выливали в н-гексан с получением осадка, который дважды повторно осаждали в той же системе растворителей.Полимерный продукт дополнительно очищали диализом с диализной мембраной (Spectra / Por, MWCO: 10–12 кДа) против метанола в течение 4 дней при комнатной температуре и против дистиллированной воды в течение 4 дней при 4 ° C. Диализованный раствор сушили вымораживанием с получением полимера I. Выход: 82%. ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ), δ (м.д.): 0,8–1,0 (с, 6H), 1,1–1,3 (ш, 3H), 1,3–1,6 (б, 2H), 1,6–1,9 ( б, 1H), 2,8–3,3 (б, 2H), 3,4–3,8 (б, 73H), 3,9 (с, 1H), 4,0–4,3 (б, 3H).

Шаг 2: [NP (IleOEt) _1.45 (Янтарная кислота) _0,14 (AMPEG750) _0,41 ] _n (Полимер II, CP-2).

Янтарный ангидрид (2,76 г, 27,58 ммоль) и 4- (диметиламино) пиридин (DMAP) (3,37 г, 27,56 ммоль), растворенные в высушенном THF, добавляли отдельно к EP (27,12 г, 45,94 ммоль) в высушенном THF. Реакционную смесь перемешивали при 40 ° C в течение 24 часов. Продукты диализовали с помощью диализной мембраны (Spectra / Por, MWCO: 10–12 кДа) против метанола в течение 4 дней при комнатной температуре и против дистиллированной воды в течение 4 дней при 4 ° C.После диализа проводили сублимационную сушку для получения полимера II. Выход: 91%. ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ), δ (м.д.): 0,8–1,0 (с, 6H), 1,1–1,3 (ш, 3H), 1,3–1,6 (б, 2H), 1,6–1,9 ( b, 1H), 2,5–2,8 (b, 2H), 2,8–3,3 (b, 2H), 3,4–3,8 (b, 62H), 3,9 (с, 1H), 4,0–4,3 (b, 3H).

Шаг 3: [NP (IleOEt) _1,45 (янтарная кислота) _0,13 (Imi) _0,01 (AMPEG750) _0,41 ] _n (И-5). Полимер II с концевыми группами карбоновой кислоты (10 г, 16.55 ммоль) растворяли в высушенном ТГФ. После охлаждения до 0 ° C добавляли диизопропилкарбодиимид (DIC; 3,58 мл, 23,17 ммоль) и N -гидроксисукцинимид (NHS; 2,67 г, 23,16 ммоль) и смесь перемешивали в течение 30 мин для активации карбоксильных групп полимер. Смесь переносили к 1–3-аминопропилимидазолу (1,45 г, 11,54 ммоль), растворенному в дистиллированном ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 0 ° C в течение 6 часов, а затем при комнатной температуре в течение 18 часов. После этого раствор концентрировали и очищали осаждением 1 М раствором фторида калия.Осадок диализовали с помощью диализной мембраны (Spectra / Por, Spectrum Laboratories, отсечка по молекулярной массе: 12–14 кДа) против дистиллированной воды в течение 3 дней при 4 ° C, и диализованный раствор лиофилизировали с получением конечного продукта (I-5). Выход: 79%. ¹ H ЯМР (CDCl3), δ (м.д.): 0,8–1,0 (с, 6H), 1,1–1,3 (b, 3H), 1,3–1,6 (b, 2H), 1,6–1,9 (b, 1H) ), 2,5–2,8 (б, 4H), 2,6–2,9 (б, 49H), 2,8–3,3 (б, 2H), 3,4–3,8 (б, 75H), 3,9 (с, 1H), 4,0–4,3 (б , 5H), 6.9–7.2 (ш, 1H), 7.4–7,6 (шир., 1H), 7,9–8,1 (с, 1H).

Приготовление раствора гидрогеля I-5

Десять процентов (по массе) полимера I-5 в растворе PBS использовали для экспериментов после фильтрации с использованием шприцевого фильтра из ацетата целлюлозы 0,2 мкм. В экспериментах, где раствор полимера I-5 должен был быть смешан с таксолом или наночастицами миРНК, было приготовлено 20% (по массе) раствора I-5.

Измерение физических свойств

Структуру полученных полимеров оценивали с помощью спектрометра Н-ЯМР ¹ (Varian Gemini-300, Agilent Technologies), работающего на частоте 400 МГц в режиме преобразования Фурье с использованием CDCl ₃ в качестве растворителя и с помощью ИК-Фурье-спектрометра (Spectrum GX FT-IR, Perkin-Elmer).Замещенное количество имидазольных групп в IP также определяли с помощью анализа BCA (Pierce). Высокопроизводительная система жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Agilent, серия 1050) также использовалась для подтверждения конъюгации имидазола. Молекулярный вес I-5 был рассчитан с использованием системы гель-проникающей хроматографии (Waters 1515, Waters) с детектором показателя преломления (Waters 2410) и двумя колонками со стирагелем (Waters styragel HR 4E и HR 5E), соединенными в линию на потоке. скорость 1 мл / мин при 35 ° C. THF, содержащий 0.В качестве подвижной фазы использовали 1% (по массе) бромида тетрабутиламмония. Полистиролы (MW: 1270; 3760; 12 900; 28 400; 64 200; 183 000; 658 000; 1 050 000; 2 510 000; 3 790 000) использовались в качестве стандартов. Вязкость водного раствора полимера I-5 измеряли с использованием вискозиметра Brookfield RVDV-III + (Brookfield) при температуре от 5 до 70 ° C при фиксированной скорости сдвига 0,1 в секунду. Измерения вязкости проводили при установленной скорости вращения шпинделя 0,2 об / мин и скорости нагрева 0,33 ° С / мин. Для испытания стабильности in vitro 10% растворы полимера смешивали с флуоресцентным красителем родамином B (в концентрации 10 мкг на 100 мкл), и 200 мкл раствора меченого полимера загружали в миллицеллы (размер пор 12.0 мкм). Миллицеллы, содержащие растворы полимеров, инкубировали 30 мин в нагретой печи при 37 ° C. Затем миллицеллы переносили в стеклянные пробирки, содержащие 3 мл PBS, и пробирки инкубировали в инкубаторе со встряхиванием, температура которого была зафиксирована на уровне 37 ° C.

Оценка биосовместимости

Для оценки цитотоксичности in vitro клетки NIh4T3 высевали в 96-луночные планшеты для тканевых культур с плотностью 1 × 10 ⁴ клеток на лунку. После инкубации в течение 24 ч клетки промывали PBS.Затем в каждую лунку добавляли 0,2 мл раствора полимера и планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ . Жизнеспособность клеток измеряли с помощью набора для анализа EZ-CYTOX (Dogen Bio) в соответствии с инструкциями производителя. Оптическую плотность определяли при длине волны 450 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов (Molecular Devices). Для тестирования биосовместимости in vivo 100 мкл 10% (по массе) вводили в подкожную подкожную клетчатку спины мышей BALB / c (6-недельного возраста, самки).За массой тела наблюдали в течение 28 дней, и в заранее определенные моменты времени проверяли наличие признаков воспаления в ткани.

Животные и хирургические процедуры

Все протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Медицинской школы Университета Аджу. В исследовании использовали взрослых самок крыс Sprague Dawley (250–300 г). Ушиб позвоночника был нанесен с помощью импактора Infinite Horizon (Precision Systems and Instrumentation).Животных анестезировали 4% хлоралгидратом (10 мл / кг, вводили внутрибрюшинно) с последующей дорсальной ламинэктомией на 10-м уровне грудного позвонка (T10-11) для обнажения дорсальной поверхности спинного мозга. Затем с помощью ударного элемента Infinite Horizon была проведена стандартизированная контузия силой 200 кДин. После травмы мышцы послойно ушили, а кожу зашили скобами. Уход за мочевым пузырем проводился два раза в день до возобновления спонтанного мочеиспускания. Инъекцию I-5 проводили через 1 неделю после ушиба, чтобы избежать потенциального повреждения тканей, связанного с самой инъекцией.Раствор гидрогеля I-5 (10%) выдерживали на льду до загрузки в шприц Гамильтона 26 G (модель 701RN) для предотвращения гелеобразования. Животных анестезировали и повторно обнажали дорсальную поверхность спинного мозга с предыдущим ушибом. После того, как ушибленная область была идентифицирована при ярком освещении, шприц Гамильтона продвигали в центр ушибленной области и вручную вводили 10 мкл раствора I-5. После инъекции шприц оставался на месте в течение 1 мин, чтобы предотвратить регургитацию введенного гидрогеля через место инъекции.Когда в I-5 вводили таксол (1 мкг / мкл) или наночастицы миРНК (см. Раздел ниже), равные объемы агента и 20% -ный (по весу) раствор I-5 смешивали с получением конечной концентрации геля 10% (по весу). Для инъекции AAV8-GFP для антероградного отслеживания кортикоспинальных аксонов крыс помещали на стереотаксическую рамку и делали разрез по средней линии над черепом для выявления брегмы. Череп, покрывающий правую сенсомоторную кору, удаляли с помощью микродрели, и вирус AAV (серотип AAV8 с промотором UbC, экспрессирующим GFP) вводили в кору через 10 мкл микрошприц Гамильтона с наконечником из вытянутой стеклянной микропипетки, прикрепленной к нанолитровому инжектору.Десять инъекций (100 нл на участок) были выполнены со скоростью 50 нл / мин при следующих координатах: 1,5 и 2,0 мм латерально; 0,7 мм глубиной; 1,0 и 1,5 мм спереди; На 0,3, 0,8 и 1,3 мм кзади от брегмы. Для инъекции BDA делали разрез по средней линии над грудными позвонками и выполняли ламинэктомию, чтобы обнажить нижележащий спинной мозг T6 – T7, и 10% BDA (10 000 MW; D1956, Invitrogen) трассер вводили в правое вентральное серое вещество (500). nl на сайт), используя следующие координаты; 0.6 мм латеральнее средней линии; глубина 1,5 и 2 мм. Игла оставалась на месте на 1 мин перед переходом к следующему участку. Головной и спинной мозг во время процедуры оставался влажным, а кожа ушивалась швами. Животных умерщвляли через три недели после введения внешних индикаторов.

Нокдаун ММР-9 наночастицами миРНК

Для нокдауна ММР-9 в ткани спинного мозга in vivo мы использовали технологию доставки миРНК, опосредованную липидными наночастицами (Precision Nanosystems). В частности, флуоресцентно меченные наночастицы SUB9KITS конъюгировали с кандидатными молекулами миРНК с последовательностями, нацеленными на ММР-9.Подтверждение опосредованного siRNA нокдауна выполняли с использованием перитонеальных макрофагов крыс. Всего на лунку 24-луночного планшета помещали 1 × 10 ⁵ перитонеальных макрофагов. После инкубации в течение 24 часов среду удаляли и клетки культивировали с наночастицами siRNA 1 мкг / мл в течение 2 дней. Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора PureLink RNA Mini Kit (Ambion) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК синтезировали из 500 нг тотальной РНК с использованием праймеров oligo dT и набора для синтеза 1-й цепи кДНК PrimeScript (Takara).Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием SYBR Premix Ex Taq в системе ABI 7500 (Applied Biosystems). Праймеры MMP-9 (NCBI: NM_031055) были сконструированы следующим образом: прямой: 5ʹ-GGCCTATTTCTGCCATGACAAATAC-3ʹ и обратный: 5ʹ-CTGCACCGCTGAAGCAAAAG-3ʹ (ожидаемый размер продукта: 141 п.н.). Праймеры для рибосомной РНК, использованные в качестве контроля загрузки, были следующими: прямой: 5ʹ-CGCGGTTCTATTTTGTTGGT-3ʹ и обратный: 5ʹ-AGTCGGCATCGTTTATGGTC-3ʹ (ожидаемый размер продукта: 240 п.н.). Нокдаун MMP-9 также был подтвержден с помощью иммуноцитохимии.После 2 дней инкубации с наночастицами siRNA 2 мкг / мл перитонеальные макрофаги фиксировали и клетки окрашивали кроличьим антителом MMP-9 (1: 100; Millipore). Для доставки in vivo миРНК повторно инкапсулировали с липидными наночастицами для получения высококонцентрированных наночастиц миРНК. Для инъекции 5 мкл наночастиц 5 мг / мл смешивали с 5 мкл 20% гидрогеля I-5.

Обработка тканей и гистохимия

Для гистологической оценки участка поражения животных умерщвляли через 1 или 4 недели после инъекции (через 2 или 5 недель после травмы) в ранние и поздние моменты времени соответственно.Животных глубоко анестезировали хлоралгидратом и внутрисердечно перфузировали PBS, затем 4% параформальдегидом в 0,1 М фосфатном буфере при pH 7,4. Затем спинной мозг был рассечен, и тканевые блоки были постфиксированы в 4% параформальдегиде в течение 2 часов, а затем подверглись криозащите в серии растворов сахарозы. Срезы спинного мозга толщиной 20 мкм были разрезаны в поперечном направлении с использованием криостата (CM 1900; Leica) и помещены на предметные стекла Super Frost Plus (Fisher Scientific). Для морфологической оценки полостей поражения серийные срезы спинного мозга подвергали окрашиванию эозином и эриохромом.Поперечные срезы спинного мозга погружали на 8 мин в окрашивающий раствор, состоящий из 240 мл 0,2% эриохромцианина RC (Sigma) и 10 мл 10% FeCl ₃ · 6H ₂ O (Sigma) в 3% растворе. HCl. Затем срезы промывали проточной водопроводной водой, а затем 1% NH ₄ OH для дифференциации. После окрашивания эриохромом цианином срезы контрастировали раствором эозина для лучшей визуализации полостей поражения. Для иммуногистохимии срезы ткани спинного мозга инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами: анти-GFAP (1: 500; Dako, # 0334), антифибронектином (1: 100; Sigma, # F36480), Iba-1 ( 1: 500; Wako, # 019-19741), анти-PDGFR-β (1: 300; Abcam), анти-коллаген 1α1 (1: 100; Santa Cruz, # sc-8784), анти-5-HT (5 -гидрокситриптамин; 1: 5000; Immunostar, # 20080), анти-MMP-9, (1: 100; Millipore, # AB19016), анти-CD45 (1: 500; Bio-Rad, # MCA589R), ant-MBP ( 1: 200; Abcam, # ab7399), CD206 (1: 500; Abcam, # ab64693) или анти-CD11b (1: 500; Bio-Rad, # MCA275R).После трехкратной промывки слайды инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa Fluor. Для окрашивания BDA использовали стрептавидин, конъюгированный с Alexa Fluor 594 (1: 500; Molecular Probes, # S32356). Изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Olympus). Для визуализации иммунореактивности GFAP в светлом поле срезы спинного мозга инкубировали с анти-GFAP (1: 2000; Dako, # 0334), а затем с биотинилированными вторичными антителами козьего анти-кроличьего IgG (1: 400), и визуализировали реакцию антиген-антитело. с использованием набора Vectastain Elite ABC (Vector) с набором субстратов пероксидазы Vector SG (Vector).

Очистка ткани и LFSM-визуализация всей ткани спинного мозга выполнялись, как описано ранее ³² . Вкратце, мозговые оболочки поврежденного спинного мозга осторожно удаляли и вырезали ткань спинного мозга длиной 8 мм с центром в области эпицентра. Образцы обезвоживали в 50%, 80% и 100% растворе THF в инкубаторе с мешалкой при комнатной температуре каждый в течение 3 часов и, наконец, переводили на свежий 100% THF на ночь. Затем растворы THF заменяли на BABB (бензиловый спирт и бензилбензоат), и образец ткани спинного мозга непрерывно инкубировали в инкубаторе с мешалкой до тех пор, пока он не стал прозрачным.После очистки ткани продольные изображения были получены с помощью LSFM (ультрамикроскоп, Lavision Biotec) при увеличении × 12,5 с толщиной между изображениями 3 мкм. Основываясь на сигналах автофлуоресценции от ткани спинного мозга, можно было выделить кистозные пространства, лишенные ткани, от остаточного спинного мозга. Границы кистозных полостей нарисованы вручную на каждом третьем снимке, а кистозные полости выделены пурпурным цветом. Сложенные изображения были преобразованы в 3D-фильм с помощью программного обеспечения Imaris (Bitplane).

Количественный анализ изображений и трехмерная реконструкция

Для количественного анализа объема полости были трехмерно реконструированы серийные срезы спинного мозга, окрашенные эриохромом и эозином. Трехмерная реконструкция полости поражения была выполнена с использованием программного обеспечения для отслеживания Neurolucida, оснащенного модулем 3D-сканирования слайдов (MBF bioscience). Для создания трехмерного изображения, соответствующего сегменту спинного мозга длиной 1 см, использовали в общей сложности 24 серийных поперечных среза спинного мозга, равномерно разнесенных на 400 мкм друг от друга.На каждом срезе вручную были нарисованы контуры внешней границы спинного мозга, белого вещества, кистозной полости, неповрежденного серого вещества и патологической ткани спинного мозга (области, в которой не сохранялась нормальная структура ткани), а затем виртуальный Программа по тканям сгенерировала трехмерные изображения. Были присвоены разные цвета, чтобы различить белое вещество ( светло-серый ), серое вещество ( зеленый ), патологическую ткань спинного мозга ( желтый ) и кистозную полость ( красный ).Программа Neurolucida автоматически рассчитала объем кистозных полостей. Для количественной оценки интенсивности Iba1-иммунореактивного сигнала три интересующих области (ROI) идентичного размера были помещены в дорсальную, латеральную и вентральную области, содержащие границы между остаточным белым веществом и поврежденной тканью с полостями в эпицентре или без них. Латеральная граница дорсальной области интереса располагалась непосредственно медиальнее дорсального рога, так что дорсальная область интереса располагалась на дорсальной колонке.Боковая область интереса располагалась чуть выше линии, пересекающей промежуточно-латеральный рог. Если промежуточно-боковой рог не мог быть идентифицирован из-за поражения, нижнюю границу боковой области интереса помещали чуть выше поперечной средней линии разреза спинного мозга. Вентральный ROI располагался ниже вентрального рога. Если вентральный рог не мог быть локализован из-за поражения, медиальную границу вентрального рога помещали на расстоянии 500 мкм от вертикальной средней линии разреза спинного мозга. Затем Iba1-иммунореактивный сигнал выше заданного порогового значения был количественно определен с использованием программного обеспечения ImageJ (общедоступно по адресу http: // imagej.nih.gov/ij/). Для количественной оценки количества двигательных нейронов ниже участка поражения были выбраны пары поперечных срезов спинного мозга (с интервалом пересечения 40 мкм) на 1,2, 1,6 и 2,0 мм каудальнее эпицентра. Срезы окрашивали эриохромом и крезиловым фиолетовым, и выжившие мотонейроны с наибольшим диаметром клеток не менее 20 мкм были идентифицированы и подсчитаны с использованием светлопольного микроскопа (Olympus BX51). Подсчитывали среднее количество мотонейронов в каждой паре.Для количественной оценки иммунореактивности ОБМ в остаточном белом веществе отбирали поперечные срезы на 2 мм ростральнее эпицентра, в эпицентре и 2 мм каудальнее от эпицентра, и окрашивали их антителом к ​​МВР. Три области интереса одинакового размера были размещены в дорсальной, латеральной и вентральной областях белого вещества. Области интереса были расположены с использованием тех же критериев, что и вышеупомянутые для количественной оценки интенсивности Iba1-иммунореактивного сигнала. Единственная разница заключалась в том, что они были помещены в остаточное белое вещество, положительное по МВР.Затем MBP-иммунореактивный сигнал выше заданного порогового значения был количественно определен с использованием программного обеспечения ImageJ. Количественную оценку плотности 5-HT аксонов в каудальных поясничных двигательных областях проводили, как описано ранее ⁹ с небольшой модификацией. Вкратце, у каждого животного были получены два поперечных среза, расположенных на 10 и 13 мм каудальнее эпицентра. Количество пикселей в вентральных моторных областях, занятых 5-HT волокнами, было количественно определено с помощью ImageJ, и это значение было нормировано на количество пикселей 5-HT волокна в вентральных моторных областях, ростральных к эпицентру.

Зимография

Для определения ферментативной активности MMP-2 и MMP-9, животных, которым вводили PBS ( N = 5) и I-5 ( N = 4), умерщвляли через 1 неделю после инъекции (2 недели после травмы). ). Сегмент спинного мозга длиной 1 см с эпицентром в середине был недавно рассечен и быстро заморожен при -70 ° C. Ткань спинного мозга гомогенизировали и обрабатывали ультразвуком в буфере RIPA. Пятьдесят мкг образца белка наносили на полиакриламидный гель, содержащий SDS и желатин, и подвергали электрофорезу.Гель регенерировали в ренатурирующем буфере (2,5% Triton X-100), чтобы позволить белкам восстановить свою ферментативную активность, а затем трижды промывали проявляющим буфером, содержащим 50 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, 5 мкМ ZnCl ₂ , 5 мМ CaCl ₂ и 0,2% Brij-35 (Sigma). Гель переносили в свежий проявляющий буфер и инкубировали при 37 ° C в течение 72 часов. Затем гель окрашивали кумасси синим в течение 2 ч с последующим обесцвечиванием в метаноле и муравьиной кислоте. Интенсивность четких полос, возникающих в результате переваривания протеазой, определяли денситометрией с использованием программного обеспечения ImageJ.

Анализ взаимодействия макрофагов in vitro с гидрофобным флуоресцентным красителем I-5

Nile Red (Sigma-Aldrich) легко взаимодействует с гидрофобной основной частью полимерных мицелл посредством гидрофобного взаимодействия и вызывает увеличение размера наночастиц. -масштабированные мицеллы ⁵⁸ . Когда 80 мкг раствора полимера смешивали с 0,1 мкг нильского красного и обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч, смесь образовывала структуры мицелл в виде частиц. Формирование наночастиц, состоящих из полимерных мицеллярных структур, было подтверждено увеличением размера после добавления нильского красного с 30 до 34 нм, как измерено с помощью Zetananosizer (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd.). Клетки RAW 264.7 (приобретенные в ATCC; ATCC TIB-71) высевали в 24-луночные планшеты (2,5 × 10 ⁴ клеток на лунку) и инкубировали в течение ночи в полной культуральной среде DMEM. Затем культуральную среду заменяли 1 мл бессывороточной среды, содержащей наночастицы, состоящие из нильского красного и полимера с имидазольной группой или без нее. Через 1 час в каждую лунку добавляли 1 мл полной среды и клетки инкубировали в течение 2 часов. После промывки PBS получали флуоресцентные изображения культивированных макрофагов с помощью конфокального микроскопа (Olympus).Интенсивность флуоресценции Nile Red определяли количественно с использованием флуоресцентного спектрофотометра (Synergy h2 Multi-mode). Чтобы определить, опосредовано ли взаимодействие гистаминовыми рецепторами, добавляли малеат мепирамина (Санта-Крус), ингибитор гистаминового рецептора 1 (h2) или JNJ7777120 (Санта-Крус), ингибитор гистаминового рецептора 4 (h5) в концентрации 20 мкМ в культивируемые клетки макрофагов за 30 мин до добавления наночастиц.

Оценка поведения

Количество животных, необходимое для поведенческого анализа, было определено на основе первоначального отчета локомоторного теста BBB в открытом поле, в котором использовалось 5–9 животных на группу ⁴⁹ .Исключались животные, показавшие 3 балла BBB и выше через 1 день после ушиба. Один субъект в группе инъекций PBS и два субъекта в группе инъекций I-5 были исключены. Сразу после ушиба животных случайным образом распределяли в группы инъекции PBS ( N = 9) или гидрогеля ( N = 8). Чтобы гарантировать слепую оценку восстановления поведения, животным были присвоены новые идентификационные коды после инъекции через 1 неделю после травмы независимым экспериментатором, который не участвовал ни в хирургии животных, ни в оценке поведения.Первоначальные идентификационные коды были доступны только независимому экспериментатору до завершения всех поведенческих экспериментов и оценок (включая анализ подиума). Восстановление опорно-двигательного аппарата оценивали с помощью локомоторной шкалы открытого поля BBB и анализа следа Catwalk (Noldus Information Technology). Крысам позволяли свободно ходить по открытому полю, и шкалу оценки двигательной активности определяли после 3-минутного сеанса наблюдения. Восстановление движений задних конечностей оценивали через 1 день после травмы, через 7 дней после травмы непосредственно перед инъекцией, а затем один раз в неделю в течение 8 недель.Для анализа походки по подиуму животных сначала обучали ходить по подиуму без перерывов. В день тестирования четыре цикла без значительных перерывов на животное были признаны действительными. Индивидуальные следы определялись вручную с помощью программного обеспечения Catwalk. Затем программа автоматически рассчитала пять параметров походки. Угол поворота задней лапы определялся как угол (в градусах) оси задней лапы относительно оси ВПП. Увеличение угла поворота указывает на внешнее вращение лапы.Основание опоры измеряли как ширину области между левой и правой задними лапами. Значения для обеих задних лап были усреднены для расчета значений длины шага и угла лапы. Следы задних лап имеют тенденцию перекрывать следы передних лап во время ходьбы у неповрежденных животных. Однако травмированные животные часто теряют координацию между задними и передними лапами ⁵⁹ . Следовательно, относительное положение передних и задних лап было получено путем прямого измерения расстояния между центральными подушечками ипсилатеральных передних и задних лап в каждом шаговом цикле.Индекс регулярности используется для объективного анализа координации походки и рассчитывается из числа нормальных шаблонов последовательности шагов, умноженного на четыре и разделенного на общее количество размещений лап ⁴³ .

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.0). Непарный тест Стьюдента t (двусторонний) был использован для сравнения средних значений двух групп. Односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным анализом Тьюки был использован для среднего сравнения трех и более групп.Двусторонний дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями использовался для сравнения различий в баллах BBB, сопоставленных в разные моменты времени.

Доступность данных

Все данные доступны у авторов по обоснованному запросу.

Техническое обслуживание и ремонт резервуаров | Matrix Service

Являясь крупнейшим подрядчиком по ремонту и техническому обслуживанию резервуаров в Северной Америке, Matrix Service предлагает широкий спектр услуг «под ключ» с учетом ваших приоритетов: безопасное снижение затрат, повышение эффективности, повышение стандартов качества и повышение производительности.

Услуги

часто предоставляются через соглашения о сотрудничестве, чтобы предоставить нашим клиентам единый источник для всех их потребностей в ремонте и техническом обслуживании резервуаров. Мы произвели бесчисленное количество замен / ремонтов днищ резервуаров, корпусов, форсунок, конструкций крыш, стальных плавающих крыш, уплотнений и люков для резервуаров всех размеров. Кроме того, мы предлагаем экологически безопасные решения для вторичной локализации и обнаружения утечек.

Наши клиенты уверены в нашей способности выполнять работу профессионально и безопасно.Как лучшие в отрасли, наши сотрудники гордятся тем, что выполняют ремонт и техническое обслуживание с точностью и точностью.

Благодаря нашей приверженности нашим клиентам, мы заработали репутацию ведущего подрядчика по ремонту и техническому обслуживанию резервуаров.

Matrix может продлить срок службы и стоимость вашего оборудования за счет полного обслуживания, модификации и ремонта, включая:

• Очистка резервуаров
• Двойное дно
• Катодная защита
• Системы обнаружения утечек
• Крыши плавающие и неподвижные
• Уплотнение плавающей крыши
• Подмости и поручни
• Форсунки и люки
• Плавающий всасывающий патрубок, диффузор, отстойники и нагревательные змеевики
• Измерительные системы
• Противопожарная защита
• Услуги по подъему и переброске цистерн
• Услуги по оказанию помощи при землетрясениях, инспекции и ремонте

Matrix Service предоставляет комплексные услуги по техническому обслуживанию в нефтяной, нефтехимической, химической и энергетической отраслях.Услуги по полному техническому обслуживанию оборудования варьируются от обычных рабочих до специализированных квалифицированных ремесленников. В нашу команду входят: такелажники, слесари, слесари, сварщики, рабочие, котельные, операторы оборудования и слесари. Мы осознаем необходимость гибкости в услугах, которые мы предоставляем нашим клиентам по техническому обслуживанию. Как подрядчик по техническому обслуживанию на месте, мы адаптируем объем наших услуг к потребностям наших клиентов. Конкретные примеры этого включают управление складом, стыковку и высвобождение судов, обслуживание территории, услуги по обеспечению безопасности или услуги по изоляции.

Переходите к более высоким стандартам. Чтобы запланировать обслуживание или узнать больше, отправьте форму ниже.

Примечание: для этого содержимого требуется JavaScript.

Жесткость внеклеточного матрикса определяет эффективность репарации ДНК и чувствительность клеток к генотоксическим агентам.

ВВЕДЕНИЕ

Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют серьезную угрозу целостности генома ( 1 ). Нерепарированные DSB вызывают нестабильность генома и клеточную трансформацию.Способность восстанавливать DSB также способствует эффективности лучевой терапии и многих химиотерапевтических средств против рака. DSB вызывает сигнальный каскад, который модифицирует хроматин, окружающий разрыв, сначала за счет зависимого от киназы атаксии и телеангиэктазии фосфорилирования гистона h3AX ( 2 — 4 ) и привлечения медиатора белка 1 контрольной точки повреждения ДНК ( MDC1) ( 5 — 7 ), за которым следуют белок 8 безымянного пальца (RNF8) — и белок безымянного пальца 168 (RNF168) -зависимое регуляторное убиквитинирование ( 8 — 10 ).Индуцированный DSB каскад убиквитинирования инициируется RNF8-зависимой конъюгацией убиквитина ( 10 — 12 ), которая способствует накоплению RNF168. RNF8 и RNF168 взаимодействуют, чтобы катализировать образование K63-связанных цепей убиквитина (Ub) на связанных с хроматином субстратах, которые включают гистоны h3A и h3AX ( 8 , 9 , 13 ). Это регуляторное событие убиквитинирования способствует независимому рекрутированию комплекса рецептор-ассоциированный белок 80 (RAP80) –BRCA1 и TP53-связывающий белок 1 (53BP1) на поврежденный хроматин ( 14 — 17 ), которые имеют решающее значение для репарации DSB. и КПП G ₂ -M.Дефицит убиквитинирования в ответе DSB приводит к нарушению репарации DSB и повышенной чувствительности опухолевых клеток к генотоксическим агентам, таким как ионизирующее излучение (IR) и химиотерапия.

Передача сигналов из внеклеточного матрикса (ЕСМ) является фундаментальным клеточным входом, который поддерживает пролиферацию, противодействует гибели клеток и регулирует дифференцировку ( 18 ). Через интегрины клетки воспринимают как химический состав, так и физические свойства ЕСМ ( 19 , 20 ).В частности, на поведение клеток сильно влияет механическая эластичность или жесткость ECM, который регулирует способность клеток развивать силы через свой сократительный актомиозиновый цитоскелет и созревать фокальные спайки. Эта способность к механочувствительности влияет на фундаментальные клеточные функции, так что изменения жесткости ВКМ в настоящее время считаются не только простым следствием патологии, но и причинным фактором, приводящим к аберрантному клеточному поведению. Напр., Жесткость ECM может регулировать YAP / TAZ (yes1 связанный регулятор транскрипции / коактиватор транскрипции с PDZ-связывающим мотивом) — опосредованную транскрипцию через RAP2.При низкой жесткости активный RAP2 связывается с киназами MST1 / 2 и MAP4K и стимулирует их, что приводит к активации большой киназы-супрессора опухолей 1 (LATS1) и LATS2 и ингибированию YAP и TAZ ( 21 , 22 ).

Жесткость матрикса на уровне ткани варьируется от модуля упругости E _мозг ~ 0,1 до 1 кПа до E _мышцы ~ 8-17 кПа до E _{остеоид} ~ 25-40 кПа ( 23 , 24 ). Хотя влияние жесткости на прогрессирование опухоли широко изучено ( 25 , 26 ), в значительной степени неизвестно, влияет ли жесткость ECM на путь восстановления DSB и химиотерапию.

Здесь мы демонстрируем, что жесткость ECM является ключевым внеклеточным регулятором пути репарации DSB. Низкая жесткость активирует передачу сигналов RAP2-MAP4K4 / 6/7, которая фосфорилирует убиквитин по Thr ⁶⁶ . Фосфорилированный убиквитин блокирует опосредованное RNF8 образование убиквитиновой цепи, что приводит к дефициту рекрутирования BRCA1 и 53BP1 и нарушению репарации DSB. Таким образом, жесткость ВКМ играет ключевую роль в репарации ДНК и контролирует клеточную чувствительность к генотоксическим агентам.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Низкая жесткость ухудшает процесс восстановления DSB и увеличивает клеточную чувствительность к генотоксическим агентам

Мы сначала проанализировали взаимосвязь между компонентом ECM и чувствительностью к химиотерапии при раке груди.Мы обнаружили, что уровень экспрессии нескольких компонентов ECM, таких как фактор роста соединительной ткани (CTGF), лизилоксидаза (LOX), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), лизилоксидаза, подобная 2 (LOXL2), и актин альфа 2 (ACTA2) тесно связаны с исходом химиотерапии. Как показано на рис. S1 (от A до F), высокая экспрессия любого из этих генов или комбинации этих множественных генов коррелировала с более низкой выживаемостью у пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение, но не у нелеченных пациентов или пациентов, получающих эндокринную терапию.Поскольку CTGF, LOX, VEGFR, LOXL2 и ACTA2 коррелировали с фиброзом и высокой жесткостью ( 27 ), мы поставили под вопрос, может ли жесткость ECM регулировать эффективность химиотерапии. Чтобы проверить эту возможность, мы обработали ксенотрансплантат опухоли молочной железы 4 T1 мыши ингибитором LOX β-аминопропионитрилом (BAPN) для снижения жесткости опухоли ( 28 ). Лечение BAPN значительно повысило чувствительность опухоли к химиотерапевтическому препарату цисплатину (рис. S1, G — I). Кроме того, комбинация BAPN и цисплатина также вызвала гораздо больший апоптоз, чем один цисплатин (рис.S1J). Эти результаты показывают, что жесткость ECM может играть прямую роль в регуляции репарации ДНК.

Чтобы выяснить, регулирует ли жесткость ECM непосредственно путь репарации DSB, мы наблюдали за событиями репарации DSB в эмбриональных клетках почки – 293 (HEK293), выращенных на акриламидных гидрогелях, покрытых фибронектином, различной жесткости от 0,5 до 30 кПа, что соответствует физиологическим показателям. эластичности естественных тканей и опухоли (рис. 1, от A до C) ( 29 — 33 ). Сначала мы исследовали, как различная жесткость регулирует клеточный ответ на генотоксический стресс.Клетки HEK293 обрабатывали IR, цисплатином, этопозидом или неокарзиностатином (NCS). Клетки с низкой жесткостью (0,5 и 1 кПа) проявляли значительно повышенную чувствительность ко всем четырем генотоксическим агентам по сравнению с клетками, выращенными на ЕСМ с высокой жесткостью (10, 20 и 30 кПа; рис. 1, D — G). Мы обнаружили, что клетки с низкой жесткостью (0,5 кПа и 1 кПа) проявляли значительно сниженную чувствительность к ингибитору циклин-зависимой киназы 4/6 Palbociclib ( 34 ), предполагая, что низкая жесткость специфически увеличивает клеточную чувствительность к агентам, повреждающим ДНК (рис. .1H). Чтобы еще раз подтвердить это, мы обнаружили соотношение апоптотических клеток с разной жесткостью после генотоксической обработки. Как показано на фиг. 1I, клетки с низкой жесткостью (0,5 и 1 кПа) проявляли значительно повышенный апоптоз после четырех генотоксических агентов по сравнению с клетками, выращенными на ЕСМ с высокой жесткостью (10, 20 и 30 кПа). В совокупности наши результаты показывают, что низкая жесткость влияет на эффективность репарации ДНК.

Рис. 1 Низкая жесткость ухудшает репарацию DSB и увеличивает клеточную чувствительность к генотоксическим агентам.

( A ) клеток HEK293, выращенных на разных поверхностях, окрашивали на F-актин и ядро. DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол. ( B ) Эластичность гидрогелей измеряли с помощью атомно-силовой микроскопии. ( C ) Измеряли эффективность покрытия фибронектином гидрогелей. ( D — H ) Клетки HEK293, выращенные на различных поверхностях, обрабатывали указанными дозами генотоксических агентов или пальбоциклибом. Для определения выживаемости клеток проводили анализы образования колоний.( I ) Клетки HEK293, выращенные на различных поверхностях, обрабатывали указанными генотоксическими агентами [10 мкМ ИК, 10 мкМ цисплатин, 10 мкМ этопозид и NCS (10 нг / мл)]. Клетки трипсинизировали через 48 часов, и клеточный апоптоз выявляли по окрашиванию аннексином V и PI. ( J ) Клетки HEK293, выращенные на разных поверхностях, обрабатывали ИК (2 Гр) и окрашивали на γ-h3AX в указанные моменты времени. ( K ) Клетки HEK293, выращенные на различных поверхностях, обрабатывали ИК (10 Гр) и собирали в указанные моменты времени для анализа нейтральных комет.Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего. Количественно оценивали более 50 клеток в группе (** P <0,01). ( L и M ) Клетки HEK293 с хромосомно интегрированным репортером HR или NHEJ помещали на разные поверхности. Эффективность NHEJ (L) и HR (M) анализировали с помощью проточной цитометрии.

Затем мы оценили клиренс повреждений ДНК после воздействия инфракрасного излучения в различных условиях жесткости ECM. Мы использовали автоматизированную иммунофлуоресцентную микроскопию для количественной оценки ядерных очагов γ-h3AX в качестве заменителя нерепарированных повреждений ДНК.В ответ на IR мы наблюдали значительно замедленный клиренс фокусов γ-h3AX в клетках, выращенных на ECM с низкой жесткостью (0,5 и 1 кПа) по сравнению с клетками, культивированными на ECM с высокой жесткостью (10, 20 и 30 кПа; рис. 1J) , предполагая отсроченную репарацию DSB в клетках с низкой жесткостью. Чтобы дополнительно подтвердить этот результат, мы контролировали DSB в клетках с помощью анализа нейтральных комет. В ответ на IR мы наблюдали значительно замедленный клиренс DSB в клетках, выращенных на ECM с низкой жесткостью (0,5 и 1 кПа), по сравнению с клетками, культивированными на ECM с высокой жесткостью (10, 20 и 30 кПа; рис.1K), что свидетельствует об отсроченной репарации DSB в клетках с низкой жесткостью.

Эукариотические клетки используют два основных пути, негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR), а также ветви этих путей для восстановления DSB. Чтобы оценить эффективность восстановления DSB, мы контролировали HR и NHEJ с помощью репортеров DR-GFP и EJ5-GFP. Эффективность как HR, так и NHEJ подавлялась в клетках с низкой жесткостью (0,5 и 1 кПа; рис. 1, L и M).

Чтобы проверить, зависит ли влияние жесткости на репарацию DSB от типа клеток, мы затем провели анализ образования колоний и анализ апоптоза в различных клеточных линиях, включая U2OS, MDA-MB-231, MCF7, A549 и MCF10A.При выращивании на низко жестком ECM все пять клеточных линий показали повышенную чувствительность к генотоксическим агентам [U2OS (рис. S2, A и B), MDA-MB-231 (рис. S2, C и D), MCF7 (рис. S2). , E и F), A549 (рис. S2, G и H) и MCF10A (рис. S2, I и J)], предполагая, что влияние жесткости на репарацию клеточного DSB является общим механизмом, общим для разных клеток. типы.

Чтобы дополнительно подтвердить влияние жесткости на репарацию ДНК, мы использовали две дополнительные модели клеточных культур, чтобы управлять жесткостью ECM.Сначала мы использовали пластины, покрытые матригелем (жесткие) и гелеобразную толстослойную (мягкую) систему матригеля (рис. S2K). По сравнению с клетками, выращенными на пластинах, покрытых матригелем (жестких), клетки, выращенные на толстом (мягком) гелеобразном матригеле, были намного более чувствительны к генотоксическим агентам (рис. S2, L и M).

Во-вторых, мы также использовали трехмерную (3D) систему культивирования с мягкими или жесткими гидрогелями ( 35 ) для анализа влияния жесткости на репарацию ДНК (например, S2N). Подобно нашей системе 2D-культивирования, клетки, выращенные на мягком гидрогеле в системе 3D-культуры, были более чувствительны к генотоксическим агентам, чем клетки, выращенные на жестком гидрогеле (рис.2O).

Рис. 2 Низкая жесткость ингибирует репарацию DSB на уровне RNF8 в пути репарации DSB.

( A — G ) Клетки HEK293 выращивали в течение 24 часов на покрытых фибронектином гидрогелях различной жесткости. Клетки фиксировали через 1 час после облучения (1 Гр) и окрашивали антителами против γ-h3AX (A), MDC1 (B), RNF8 (C), FK2 (D), 53BP1 (F) и BRCA1 (G). Для RNF168 (E) клетки HEK293, экспрессирующие mCherry-RNF168, помещали на покрытые фибронектином гидрогели различной жесткости.Клетки фиксировали через 1 час после облучения (1 Гр) и фокусы RNF168 визуализировали с помощью mCherry. Количественная оценка описана в разделе «Методы». Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, n = 3 биологически независимых образца (** P <0,01). ( H ) Модель, демонстрирующая этапы репарации поврежденной ДНК за счет низкой жесткости.

Чтобы подтвердить влияние жесткости на репарацию ДНК в моделях ксенотрансплантатов, мы использовали полусинтетические гидрогели на основе гиалуронана ( 36 ) (мягкие, 0.4 кПа; жесткость, 9 кПа), чтобы имитировать жесткость солидной опухоли. Жесткость ECM не влияла на воздействие химиотерапии на опухоль, поскольку образцы опухоли из обоих гелей (0,4 и 9 кПа) показали одинаковый хвостовой момент через 6 часов после обработки цисплатином (рис. S2P). На этой модели мышей мы дополнительно проверили, влияет ли жесткость на чувствительность к цисплатину. Как показано на рис. S2 (от Q до S), опухоли низкой жесткости были более чувствительны к цисплатину. Кроме того, цисплатин также индуцировал гораздо больший апоптоз в опухоли при мягком ВКМ, чем при жестком ВКМ (рис.S2T), что указывает на то, что жесткость ECM влияет на реакцию опухоли на химиотерапию.

Низкая жесткость подавляет репарацию DSB на уровне RNF8 в пути репарации DSB

В процессе репарации DSB белки репарации DSB привлекаются к сайту DSB. Этот процесс, по-видимому, происходит поэтапно, при этом восходящие белки демонстрируют более быструю кинетику. Мы стремились точно определить шаг во время передачи сигналов восстановления DSB, который чувствителен к низкой жесткости. Низкая жесткость не оказала заметного влияния на самые ранние стадии реакции на повреждение ДНК, поскольку сборка фокусов γ-h3AX, MDC1 и RNF8 в значительной степени не изменилась (рис.2, от А до С и рис. S3, от A до B). Однако конъюгация убиквитина в сайте DSB была заблокирована в клетках с низкой жесткостью (фиг. 2D и фиг. S3B). Рекрутирование RNF168, 53BP1 и BRCA1 в сайты повреждения ДНК также блокировалось при низкой жесткости (рис. 2, E – G и рис. S3, C – D). Поскольку рекрутирование RNF168, 53BP1 и BRCA1 зависит от передачи сигналов убиквитина, опосредованной RNF8, мы, таким образом, пришли к выводу, что низкая жесткость ингибирует репарацию DSB посредством модуляции передачи сигналов убиквитина, опосредованной RNF8 (Fig. 2H).

Ингибирование репарации DSB с помощью низкой жесткости зависит от Rap2

Далее мы попытались исследовать, как жесткость ECM влияет на передачу сигналов убиквитина, опосредованную RNF8. Известно, что путь Hippo-YAP регулируется жесткостью ECM ( 24 ). Недавние исследования показали, что путь RAP2-Hippo является прямой связью между жесткостью ECM и внутриклеточными процессами. Низкая жесткость может активировать RAP2 и расположенные ниже киназы гиппокиназы MST1 / 2 и MAP4K4 / 6/7 (рис. S4A).Таким образом, мы проверили, участвует ли Rap2 в регуляции репарации DSB, количественно определяя IR-индуцированные фокусы. Используя клетки с нокаутом Rap2 (KO), мы дополнительно подтвердили влияние Rap2 на ингибирование репарации ДНК за счет низкой жесткости. Как показано на рис. S4 (от B до J), клетки Rap2 KO с низкой жесткостью восстанавливали фокусы FK2 / 53BP1 / BRCA1. Кроме того, при низкой жесткости клетки Rap2 KO стали более устойчивыми к IR по сравнению с контрольными клетками (рис. S4K), что указывает на то, что Rap2 необходим для ингибирования репарации ДНК за счет низкой жесткости.

Ингибирование репарации DSB за счет низкой жесткости зависит от MAP4K4 / 6/7

Мы дополнительно проверили, регулируют ли расположенные ниже киназы MST1 / 2 и MAP4K4 / 6/7 киназы гиппопотама репарацию ДНК. Чтобы проверить роль киназ MST1 / 2 и MAP4K в регуляции репарации DSB, мы использовали нокаут MST1 / 2 (MM2KO), нокаут MAP4K4 / 6/7 (MM3KO) и нокаут MST1 / 2 и MAP4K4 / 6/7 (MM5KO). ) клеточных линий, чтобы определить вклад гиппокиназ в регуляцию репарации ДНК (рис. 3А). При низкой жесткости клетки дикого типа демонстрировали пониженные фокусы FK2, 53BP1 и BRCA1 на сайтах DSB.Клетки MM3KO и MM5KO, но не клетки MM2KO, восстанавливали фокусы FK2, 53BP1 и BRCA1 при низкой жесткости (рис. 3, от B до J), указывая на то, что киназы MAP4K4 / 6/7 опосредуют дефицит передачи сигналов убиквитина при низкой жесткости. Истощение киназ MAP4K4 / 6/7, но не MST1 / 2, привело к почти полному восстановлению HR и NHEJ в клетках с низкой жесткостью (рис. 3, K и L). Выживаемость после облучения также восстанавливалась в клетках MM3KO при низкой жесткости (рис. 3М). Эти данные показывают, что MAP4K4 / 6/7, но не MST1 / 2, опосредуют ингибирование репарации ДНК за счет низкой жесткости.

Рис. 3 Ингибирование восстановления DSB за счет низкой жесткости зависит от MAP4K4 / 6/7.

( A ) Вестерн-блоттинг, показывающий уровни экспрессии MST1, MST2, MAP4K4, MAP4K6 и MAP4K7 в контрольных (MM0), MM2KO, MM3KO и MM5KO HEK293 клетках. M _w , среднемассовая молекулярная масса. ( B — D ) Клетки MM0, MM2KO, MM3KO и MM5KO выращивали на мягких (1 кПа) и жестких (30 кПа) гидрогелях, покрытых фибронектином. Клетки фиксировали через 1 час после облучения (1 Гр) и окрашивали антителами против γ-h3AX и MDC1 (B), RNF8 и FK2 (C) и 53BP1 и BRCA1 (D).Шкала 10 мкМ. ( E — H ) Количественное определение от (B) до (D) описано в разделе «Методы». ( K и L ) Клетки MM0, MM2KO, MM3KO и MM5KO выращивали на мягких (1 кПа) и жестких (30 кПа) гидрогелях, покрытых фибронектином. Влияние жесткости ECM на эффективность NHEJ (K) и HR (L) в указанных клетках анализировали с помощью проточной цитометрии. ( M ) Киназы MAP4K4 / 6/7 необходимы для регуляции чувствительности к излучению, индуцированной жесткостью. Были проведены анализы образования колоний для изучения выживаемости клеток WT (MM0) и MM3KO HEK293 на мягких (1 кПа) и жестких (30 кПа) гидрогелях, покрытых фибронектином, при воздействии указанных доз радиации.

Таким образом, мы спросили, регулируют ли MAP4 / 6/7 репарацию ДНК посредством их нижестоящего пути передачи сигналов LATS-YAP. Чтобы проверить это, мы использовали нокаут-клетки LATS1 / 2 и нокаут-клетки YAP / TAZ (рис. S5, A и B). Как показано на рис. S5 (от C до K) в клетках с нокаутом LATS1 / 2 или YAP / TAZ низкая жесткость все еще блокирует образование фокусов FK2 / 53BP1 / BRCA1. Более того, низкая жесткость также влияла на эффективность HR и NHEJ (рис. S5, L и M) и клеточную чувствительность к IR (рис. S5N) в нокаутных клетках LATS1 / 2 и YAP / TAZ, как и в контрольных клетках.Эти результаты предполагают, что ингибирование репарации ДНК киназами MAP4K4 / 6/7 при низкой жесткости не зависит от LATS1 / 2-YAP.

Киназы MAP4K4 / 6/7 фосфорилируют убиквитин по Thr

⁶⁶

Непосредственное влияние киназ MAP4K4 / 6/7 на формирование очагов FK2 побудило нас проверить, подавляют ли эти киназы активность лигазной системы RNF8 E3 в полностью рекомбинантной системе. Реакции убиквитинирования были собраны с RNF8 в присутствии или в отсутствие киназ MAP4K4 / 6/7. Киназы MAP4K4 / 6/7 эффективно ингибировали RNF8-опосредованную сборку убиквитиновой цепи (рис.S6, A и B), что указывает на то, что один или несколько компонентов каскада убиквитина могут фосфорилироваться киназами MAP4K4 / 6/7.

Затем мы попытались определить субстраты киназ MAP4K4 / 6/7 в реакции убиквитинирования. Анализы киназ in vitro проводили с E1, E2, E3 или убиквитином, смешанным с киназами MAP4K4 / 6/7, и образцы подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с фос-меткой (PAGE). Не было обнаружено заметного сдвига на E1, E2 или E3 с использованием геля с фос-меткой (рис. S6, C — F), тогда как одна форма убиквитина с замедленной подвижностью была определена особенно (рис.4A), что указывает на то, что сам моноубиквитин фосфорилируется киназами MAP4K4. Для определения сайта фосфорилирования фосфорилированный убиквитин трипсинизировали и подвергали тандемному масс-спектрометрическому анализу с жидкостной хроматографией (LC-MS / MS). Был идентифицирован один фосфорилированный пептид убиквитина 64-72 (ESpTLHLVLR) (фиг. 4B), что свидетельствует о фосфорилировании Thr ⁶⁶ . Фосфорилированный убиквитин может специфически распознаваться нашим самодельным антителом против pT66 (рис. 4C). Мы обнаружили, что помимо мономера Ub, различные цепи убиквитина также могут фосфорилироваться киназами MAP4K4 in vitro (рис.4D). Чтобы подтвердить сайт фосфорилирования на убиквитине, мы мутировали Thr ⁶⁶ на убиквитине в аланин (T66A). Мутация Thr ⁶⁶ предотвращала фосфорилирование убиквитина с помощью киназ MAP4K4 (рис. 4E).

Рис. 4 Киназы MAP4K4 / 6/7 фосфорилируют убиквитин in vitro и в клетках.

( A ) Анализ киназы in vitro выполняли при 30 ° C в течение 1 часа в присутствии свободного Ub и указывали на очищенные киназы. Образцы обрабатывали на PAGE без фос-метки или фос-метки, и гели подвергали блоттингу с использованием антител против Ub.WB — вестерн-блоттинг; MW, молекулярная масса. ( B ) Гелевую полосу фосфорилированного убиквитина обрабатывали трипсином и подвергали анализу LC-MS / MS. ( C ) Образцы обрабатывали, как в (A), и подвергали блоттингу антителом против pT66. ( D ) Анализ киназы in vitro проводили с различными цепями тетра-Ub и MAP4K4. Гели подвергали вестерн-блоттингу с антителом против pT66 (вверху) или антителом против Ub (внизу). ( E ) Анализ киназы in vitro проводили с указанными белками Ub и очищенными киназами.Образцы обрабатывали на PAGE без фос-метки или фос-метки, и гели подвергали блоттингу с использованием антител против Ub или pT66. WT, дикий тип. ( F ) Клетки HEK293, выращенные на пластиковых планшетах, трансфицировали указанными конструкциями, и фосфорилирование убиквитина в клетках детектировали с помощью антитела против pT66. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. ( G — J ) Указанные клетки культивировали на покрытых фибронектином гидрогелях низкой (1 кПа) и высокой (30 кПа) жесткости в течение 24 часов.Лизаты клеток зондировали указанными антителами. Актин использовался в качестве контроля нагрузки.

Затем мы проверили, регулируется ли фосфорилирование убиквитина жесткостью ECM в клетках. Как показано на рис. S7A, низкая жесткость, заметно индуцировала фосфорилирование убиквитина. Хотя путь Hippo может регулироваться множеством сигналов, таких как плотность клеток, сывороточное голодание и энергетический стресс, фосфорилирование убиквитина лишь незначительно индуцировалось этими сигналами по сравнению с состоянием низкой жесткости (рис.S7A). Мы также обнаружили, что фосфорилирование убиквитина индуцировалось во многих клеточных линиях с низкой жесткостью, указывая на то, что это фосфорилирование является общим событием для разных клеточных линий (рис. S7B). Более того, мы обнаружили, что фосфорилированный убиквитин в основном локализован в ядре, что указывает на то, что он может главным образом регулировать ядерные события (рис. S7C). Чтобы продемонстрировать фосфорилирование Ub в клетках, лизаты клеток с низкой жесткостью обрабатывали трипсином и подвергали анализу LC-MS / MS.От шестидесяти четырех до 72 pT66 были идентифицированы с высокой достоверностью, что свидетельствует о фосфорилировании pT66 в клетках (рис. S7D).

Поскольку киназы MAP4K4 / 6/7 фосфорилировали убиквитин in vitro, мы проверили, регулирует ли MAP4K4 / 6/7 уровень фосфорилирования убиквитина в клетках. Сверхэкспрессия киназ MAP4K4 / 6/7 увеличивала уровень фосфорилирования убиквитина (рис. 4F). Нокаут-киназы MAP4 / 6/7 снижали фосфорилирование убиквитина в клетках при низкой жесткости, в то время как нокаут-киназы MST1 / 2 не оказывали заметного эффекта (рис.4G). Чтобы проверить, требуется ли киназная активность MAP4K4 / 6/7 для фосфорилирования убиквитина, мы воссоздали мутант MAP4K4 дикого типа (MAP4K4 WT) и мутант с мертвой киназой (MAP4K4 KD) в клеточные линии MM3KO. Как показано на фиг. 4H, фосфорилирование убиквитина при низкой жесткости восстанавливается в клетках, экспрессирующих MAP4K4 WT, но не в клетках, экспрессирующих MAP4K4 KD. В соответствии с вышестоящей ролью Rap2, отключение Rap2 блокирует фосфорилирование убиквитина в клетках с низкой жесткостью (рис. 4I), однако отключение LATS1 / 2 или YAP / TAZ не оказывает заметного влияния на фосфорилирование убиквитина (рис.4J), указывая на то, что путь Rap2-MAP4K4 / 6/7, но не сигнал LATS1 / 2-YAP, необходим для индуцируемого низкой жесткостью фосфорилирования убиквитина.

Фосфорилирование убиквитина блокирует опосредованную RNF8 конъюгацию убиквитина in vitro и в клетках.

Затем мы исследовали роль фосфорилирования убиквитина в опосредованной RNF8 сборке убиквитиновой цепи. Сначала мы исследовали, влияет ли фосфорилированный убиквитин на RNF8-опосредованную сборку цепи убиквитина. Сначала мы очистили фосфорилированный убиквитин с помощью системы биосинтеза ( 37 ).С очищенным фосфорилированным убиквитином (рис. 5, A и B) мы провели тесты убиквитинирования in vitro. Фосфорилированный убиквитин блокировал сборку убиквитиновой цепи, катализируемую UbcH5C / RNF8 (рис. 5C). Сообщается, что RNF8 работает с несколькими другими E2, такими как Ubc13, UBE2E1, UBE2E2 и UBE2E3 ( 38 ). Мы обнаружили, что фосфорилирование убиквитина блокирует образование цепи, когда разные E2s используются вместе с RNF8 (Fig. 5D).

Рис. 5 Фосфорилирование убиквитина блокирует опосредованную RNF8 / RNF168 конъюгацию убиквитина in vitro и в клетках.

( A ) Очищенные варианты Ub анализировали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. ( B ) Варианты Ub обрабатывали λ-PPазой или без нее и подвергали блоттингу указанными антителами. ( C ) Сборку убиквитиновых цепей определяли в присутствии Ube1, UbcH5c и RNF8 и указывали варианты Ub. Образцы были взяты в указанное время и подвергнуты иммуноблоттингу с использованием антител против Ub. ( D ) Сборку убиквитиновых цепей определяли в присутствии Ube1, указывали E2s, RNF8 и указывали варианты Ub.Цепи полиубиквитина детектировали иммуноблоттингом с антителом против Ub. ( E ) Сборку цепей убиквитина определяли в присутствии Ube1, UbcH5c, RNF8 и указывали варианты Ub. Образцы были взяты в указанное время и подвергнуты иммуноблоттингу с использованием антител против Ub. ( F ) HEK293, экспрессирующий WT, T66A и мутантный убиквитин T66E, подвергали блоттингу с антителом против Ub. ( G ) Клетки, как в (F), трансфицировали указанными плазмидами. Клетки облучали (10 Гр) и блотировали антителом против НА.(От H до J ) Клетки, как в (F), выращивали на покровных стеклах. Клетки фиксировали через 1 час после облучения (1 Гр) и окрашивали указанными антителами. ( K — P ) Количественное определение от (H) до (J). ** P <0,01.

Затем мы попытались определить стадию реакции убиквитинирования, которая чувствительна к фосфорилированному убиквитину. Неудивительно, что фосфорилированный убиквитин заряжен на E2 в той же степени, что и нефосфорилированный убиквитин (рис.S8A), что указывает на аналогичную эффективность конъюгации E2. Таким образом, мы предположили, что фосфорилирование убиквитина может влиять на активность RNF8 за счет нарушения рецепторной функции убиквитина. Как показано на рис. S8B, высвобождение UbcH5c ~ Ub с помощью RNF8 ингибировалось фосфорилированным убиквитином. Эти результаты показывают, что фосфорилирование убиквитина ингибирует опосредованную RNF8 разрядку UbcH5c. Фосфорилированный убиквитин не влиял на MDM2- или X-связанный ингибитор апоптоза (XIAP) — опосредованную сборку убиквитиновой цепи (расширенные данные; рис.S8, C и D), указывая на то, что эффект фосфорилированного убиквитина может быть ограничен некоторыми специфическими лигазами E3, а не глобальной системой убиквитина.

Для изучения роли фосфорилирования убиквитина в регуляции репарации ДНК мы сначала использовали мутантный фосфомиметический убиквитин T66E. Мутантный фосфомиметический убиквитин T66E полностью блокировал RNF8-опосредованную сборку убиквитиновой цепи (фиг. 5E), что указывает на то, что фосфомиметический убиквитин выполняет ту же функцию, что и реальный фосфорилированный убиквитин. Таким образом, мы создали клеточные линии, стабильно экспрессирующие убиквитин дикого типа (WT), T66A или мутант T66E, и ​​оценили их влияние на путь репарации DSB (рис.5F). Мы наблюдали блокирующий эффект фосфорилирования убиквитина на убиквитинирование гистонов h3A и h3Ax мутантом T66E (рис. 5G). Более того, мы также наблюдали резкое подавление индуцированной повреждением ДНК конъюгации убиквитина на хроматине (фокусы FK2) и образование фокусов 53BP1 и BRCA1 в клетках, экспрессирующих мутант T66E (рис. 5, H-P). Эти результаты убедительно подтверждают, что фосфорилирование убиквитина по Thr ⁶⁶ нарушает конъюгацию убиквитина в сайтах DSB.

Фосфорилирование убиквитина, опосредованное дефицитом репарации ДНК при низкой жесткости

Для изучения физиологической функции фосфорилирования Ub в клетках с низкой жесткостью мы использовали стратегию замены Ub в клетках HEK293, при которой все эндогенные копии Ub были истощены доксициклином (DOX ) -Индуцируемая РНК-интерференция при одновременной экспрессии устойчивых к короткой шпильке РНК (shRNA) Ub WT и Ub T66A, слитых с N-концом рибосомных белков L40 и S27a от DOX-чувствительного промотора (рис.S9A) ( 39 ). Иммуноблоттинг экстрактов продемонстрировал аналогичные уровни белков Ub WT, Ub T66A и T66E после индукции DOX в течение 3 дней (рис. S9B). В этой системе замены Ub низкая жесткость индуцирует фосфорилирование Ub только в клетках, экспрессирующих Ub T66A или Ub T66E (рис. S9C), что дополнительно подтверждает, что низкая жесткость приводит к фосфорилированию Ub на уровне T66 в клетках.

Низкая жесткость снижает фокусы FK2, 53BP1 и BRCA1 в убиквитин-замещающих клетках HEK293, экспрессирующих убиквитин дикого типа (рис.6, от A до F, и рис. S9, D — F). Однако низкая жесткость мало влияла на фокусы FK2, 53BP1 и BRCA1 в клетках HEK293, замещающих убиквитин, экспрессирующих мутантный убиквитин T66A, что позволяет предположить, что фосфорилирование Ub-T66 отвечает за нарушение репарации DSB при низкой жесткости. Примечательно, что в клетках HEK293 с заменой убиквитина, экспрессирующих мутантный T66E убиквитин, фокусы FK2, 53BP1 и BRCA1 блокировались независимо от того, культивировали ли клетки на жестком или мягком гидрогеле. Эти результаты показали, что фосфорилирование убиквитина опосредовано дефицитом репарации ДНК в клетках в условиях низкой жесткости.Мы дополнительно протестировали эффекты фосфорилирования убиквитина на HR и NHEJ. И HR, и NHEJ ингибировались в клетках WT при низкой жесткости, но не затрагивались в клетках, экспрессирующих убиквитин T66A (фиг. 6, G и H). Более низкие показатели выживаемости в ответ на генотоксические агенты также были обращены в клетках, экспрессирующих убиквитин T66A с низкой жесткостью (рис. 6, I – L). В целом, мы предполагаем, что MAP4K4 / 6/7-опосредованное фосфорилирование убиквитина приводит к дефициту репарации DSB в клетках в условиях низкой жесткости (рис.S9G).

Рис. 6. Фосфорилирование убиквитина, опосредованного блокадой репарации ДНК в клетках с низкой жесткостью.

( A — F ) Замещающие убиквитин клетки HEK293, экспрессирующие мутантный убиквитин дикого типа (WT), T66A или T66E, высевали на мягкие (1 кПа) и жесткие (30 кПа) гидрогели, покрытые фибронектином. Клетки фиксировали через 1 час после облучения и окрашивали антителами против γ-h3AX (A), MDC1 (B), RNF8 (C), FK2 (D), 53BP1 (E) и BRCA1 (F). Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, n = 3 биологически независимых образца (** P <0.01). ( G и H ) Фосфорилирование убиквитина ингибирует HR и NHEJ. Влияние фосфорилирования убиквитина на эффективность NHEJ (G) и HR (H) анализировали с помощью проточной цитометрии. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. n = 3 биологически независимых образца (** P <0,01). ( I — L ) Фосфорилирование убиквитина регулирует генотоксическую чувствительность. Замещающие убиквитин клетки HEK293, экспрессирующие мутантный убиквитин дикого типа (WT), T66A или T66E, высевали на мягкие (1 кПа) гидрогели, покрытые фибронектином.Клетки обрабатывали указанными генотоксическими агентами. Анализы образования колоний проводили для изучения выживаемости клеток, экспрессирующих мутантный убиквитин дикого типа (WT), T66A или T66E, на мягких (1 кПа) гидрогелях, покрытых фибронектином. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. n = 3 биологически независимых образца.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы заключаем, что клетки ограничивают репарацию ДНК при низкой жесткости, которая соответствует статусу проапоптоза в мягких тканях. Это может представлять собой эволюционную стратегию клетки для поддержания стабильности генома.В условиях низкой жесткости активируется путь Hippo-LATS ( 40 ), который способствует апоптозу и ингибирует передачу сигналов для выживания. Между тем, низкая жесткость также ингибирует путь репарации ДНК посредством передачи сигналов Rap2-MAP4K4 / 6/7-убиквитина, что вызывает медленный клиренс поврежденной ДНК и дополнительно усиливает проапоптотическую передачу сигналов. Эти два эффекта вместе ограничивают рост генетически нестабильных популяций клеток, вызывая их гибель.

Жесткость ЕСМ контролирует путь HIPPO-YAP, влияющий на рост клеток.Как показано на рис. S5B, клеточный цикл был частично остановлен при низкой жесткости. Процент клеток G ₁ увеличился примерно на 8% от жесткого до мягкого матрикса. Это изменение клеточного цикла может способствовать снижению эффективности ЧСС. Однако мы не думаем, что это 8% изменение будет преобладать над заметным изменением HR и уменьшением NHEJ на рис. 1 L и M). Чтобы исключить влияние пути HIPPO и клеточного цикла, мы дополнительно использовали клетки LATS1 / 2 KO и клетки TAZ / YAP KO, чтобы проверить влияние жесткости ECM на HR и NHEJ.Как показано на рис. S5B, влияние жесткости на клеточный цикл блокировалось в клетках LATS1 / 2 KO и клетках TAZ / YAP KO. Однако в этих клетках низкая жесткость также влияет на эффективность HR и NHEJ (рис. S5, L и M) и клеточную чувствительность к IR (рис. S5N), указывая на то, что жесткость ECM может регулировать репарацию ДНК независимо от эффекта клеточного цикла.

Мы также заметили небольшое уменьшение количества очагов γ-h3AX при низкой жесткости (рис. 2А). Это указывает на то, что на начальные стадии повреждения ДНК, такие как активация ATM и мейотическая рекомбинация 11 гомолог A (MRE11), также может влиять жесткость ECM.Однако этот эффект кажется очень слабым. Как показано на фиг. 2 (B и C), небольшое изменение в фокусах γ-h3AX не оказывает значительного влияния на последующие эффекторы, такие как рекрутинг MDC1 и RNF8. Таким образом, в нашем текущем исследовании мы в основном сосредоточились на дефекте убиквитинирования.

Передача сигналов убиквитина играет важную роль в координации рекрутирования факторов репарации DSB, таких как BRCA1 и 53BP1. Обширные исследования выявили компоненты системы убиквитина, которые регулируют передачу сигналов убиквитина после повреждения ДНК ( 8 , 9 , 13 — 17 , 38 ).Здесь мы показали, что фосфорилирование убиквитина в T66 блокирует эту передачу сигналов убиквитина, обеспечивая ранее неизвестный уровень регуляции убиквитина в процессе репарации DSB. Дальнейший структурный анализ предоставит более подробную информацию о механизме, касающемся того, как это фосфорилирование влияет на RNF8-опосредованную систему убиквитина. Помимо своей роли в репарации DSB, убиквитин также участвует во многих клеточных процессах. Хотя фосфорилирование убиквитина в точке T66 не влияет на некоторые системы убиквитина E3, такие как MDM2 и XIAP (расширенные данные; рис.S8, C и D), мы не могли исключить возможность того, что фосфорилирование убиквитина на T66 имеет дополнительные эффекты внутри и вне пути ответа на повреждение ДНК (DDR).

В нашем текущем исследовании мы обнаружили, что жесткость ВКМ может быть важным фактором, регулирующим генотоксическую чувствительность. Таким образом, жесткость опухоли может использоваться в качестве потенциального биомаркера для прогнозирования результатов химиотерапии и лучевой терапии. Кроме того, мы обнаружили, что ингибирование репарации ДНК при низкой жесткости зависит от киназ MAP4K4 / 6/7.Учитывая, что фосфорилирование убиквитина обратимо, некоторые фосфатазы в клетках должны быть способны удалять фосфорилирование убиквитина и способствовать процессу репарации DSB. Фармакологическая активация киназ MAP4K4 / 6/7 или ингибирование мощной фосфатазы может способствовать фосфорилированию убиквитина и ингибировать репарацию DSB, обеспечивая потенциальные терапевтические стратегии для усиления ответа на DSB.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Антитела были получены из следующих источников: Ub (Santa Cruz Biotechnology, sc-8017), актин (Sigma-Aldrich, A2228), γ-h3AX (Millipore, 05-636), FLAG. (Sigma-Aldrich, F1804), HA-tag [HA; Cell Signaling Technology (CST), 5017], Myc (Santa Cruz Biotechnology, 9E10), 53BP1 (Novus Biologicals, NB100-304), BRCA1 (Santa Cruz Biotechnology, sc-6954), FK2 (Millipore, 04-263), RNF8. (Novus Biologicals, H00009025-D01P, антитело против убиквитина), MAP4K4 (Bethyl, A301-503A), MAP4K6 (Novus, NBP1-22990), MAP4K7 (Genetex, GTX13141), YAP / TAZ (Santa Cruz Biotechnology, sc-101199 ), V5 (Abcam, ab9116), pLATS1 T1079 (CST, 8654), LATS1 (CST, 3477), LATS2 (CST, 5888), MST1 (CST, 3682), MST2 (CST, 3952) и Rap2 (Biosciences, 610215).Флуоресцеин-фаллоидин приобретали у Invitrogen (F432). Акриламид Phos-tag (304-93521 / AAL-107) был приобретен у Wako Chemicals. UBE1 (E1-304), UbcH5c (E2-627), UbcH6 / UBE2E1 (E2–630), UbcH9 / UBE2E3 (E2–678), комплекс UBE2N / UBE2V1 (Ubc13 / Uev1a) (E2–664), Ub (U -100H), Mdm2 / HDM2 Ubiquitin Ligase Kit (K-200b) и XIAP Ubiquitin Ligase Kit (K-250) были от R&D Systems. UBE2E2 были от Sigma-Aldrich (SRP6150-3NMOL). Белки RNF8 и RNF168 были приобретены у Abnova. Киназы MST1, MST2, MAP4K4, MAP4K6 и MAP4K7 были от SignalChem Inc.Неокарзиностатин (N9162), этопозид (E1383) и цисплатин (BP809) были от Millipore. Цепи тетраубиквитина (Ub4) M1-linear, K6, K11, K29, K33, K48 и K63 были приобретены в Boston Biochem.

Культура клеток и трансфекция

Клеточные линии HEK293, MCF-7, A549, U2OS и MDA-MB-231 были приобретены из Американской коллекции типовых культур. Идентичность всех клеточных линий была подтверждена лабораторией медицинского генома в Mayo Clinic Center (Рочестер, Миннесота) с использованием профилирования с короткими тандемными повторами при получении.Клетки с нокаутом Rap2 (Rap2KO), MM2KO, MM3KO, MM5KO, LATS1 / 2 (LATS1 / 2 KO) и нокаутом YAP / TAZ (YAP / TAZ KO) были щедро предоставлены К. Гуаном (Калифорнийский университет в Сан-Диего, Калифорния ). Клеточные линии поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), McCoy’s 5A и RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой, соответственно. Трансфекцию плазмид проводили с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine 2000 от Thermo Fisher Scientific Inc. Для низкого слияния 1,5 × 10 ⁵ клеток на лунку высевали на шестилуночные планшеты.Для высокого слияния на лунку засевали 8 × 10 ⁵ клеток. Для всех других обработок клетки с низкой степенью конфлюэнтности обрабатывали 2-дезоксиглюкозой (25 мМ), депривацией сыворотки и LatA (1 мкг мл ^-1 ).

Ub-система замены

HEK293 родительские Ub-замещающие клетки были получены в соответствии с предыдущим протоколом, предоставленным Z. J. Chen (Юго-западный медицинский центр Техасского университета, Даллас, Техас). Все замещающие клетки Ub получали, как описано ранее ( 25 ).Клеточная линия HEK293, стабильно экспрессирующая Ub shRNA и мутанты Ub WT, T66A и T66E, поддерживалась в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, не содержащей тетрациклина (Takara). Когда указано, в среду добавляли DOX.

Плазмиды

MAP4K4, MAP4K6 и MAP4K7 были клонированы в pLEX_307 с тегом V5. Мертвый мутант киназы MAP4K4 K54R был получен посредством сайт-направленного мутагенеза (StrataGene). Плазмиды pTO-sh Ub и pTO-Ub-WT были предоставлены Z. J. Chen (Юго-западный Юта). pTO-Ub-T66A и pTO-Ub-T66E получали сайт-направленным мутагенезом (StrataGene).Плазмида, кодирующая His-tag USP2cc (pET15-USP2cc), была подарком У. Харпера (Гарвардская медицинская школа) и Э. Дж. Беннета (Калифорнийский университет в Сан-Диего). Ub дикого типа клонировали в вектор pET-28a (Novagen). T66A и T66E были получены посредством сайт-направленного мутагенеза (StrataGene).

Культура клеток с гидрогелями на основе полиакриламида для 2D- и 3D-культивирования

Гидрогели различной жесткости были получены, как описано в другом месте ( 41 ), и модуль упругости был измерен с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ).Фибронектин плаценты человека (10 мкг / мл) использовали для покрытия активированных сульфо-санпа гидрогелей. Эффективность покрытия фибронектином измеряли, как описано ранее ( 42 ). 3D-культура следовала протоколу, описанному в другом месте ( 35 ).

Культура клеток с толстым слоем матригеля и пластиной, покрытой матригелем

Планшеты покрывали в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, для покровных стекол, покрытых матригелем, покровные стекла инкубировали с 2% матригелем при комнатной температуре в течение 1 часа.Для толстослойных гелей Matrigel (от 150 до 200 мкл / см ² ) наносили на покровные стекла.

Фракционирование хроматина

Фракционирование хроматина выполняли в основном, как описано ранее, но с несколькими модификациями ( 43 ). Клетки дважды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) и собирали подходящим объемом ледяного PBS с последующим центрифугированием при 1000 g в течение 1 мин. Затем клетки предварительно экстрагировали цитоскелетным (CSK) буфером, содержащим 100 мМ NaCl, 1 × ингибиторы протеазы (PI), 10 мМ NaF, 20 мМ N -этилмалеимид, 0.25 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и рибонуклеаза A (0,3 мг / мл) в течение 5 минут при комнатной температуре. Фракции хроматина (фракция осадка) получали центрифугированием при 2000 g в течение 5 минут при 4 ° C и солюбилизировали обработкой ультразвуком. Концентрацию белка в клеточных экстрактах определяли с помощью реагента для анализа белка кумасси (Thermo Fisher Scientific).

Очистка убиквитина

Конструкции его _{6 Убиквитин с меткой} для бактериальной экспрессии экспрессировались в клетках BL21 путем индукции 150 мкМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозида [IPTG; оптическая плотность при 600 нм (OD ₆₀₀ ) ~ 1.0] при 18 ° C. Клетки выращивали при 18 ° C в течение 12 часов и лизировали ультразвуком в буфере для связывания His [50 мМ трис-Cl (pH 8,0), 5 мМ имидазол, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA и 1 мМ PMSF]. После центрифугирования (45000 г , 30 мин, 4 ° C) супернатант наносили на гранулы h Ni – нитрилотриуксусной кислоты (NTA) агарозы (Qiagen), перемешивали в течение 1 часа при 4 ° C, а затем промывали в His- промывочный буфер [50 мМ трис-Cl (pH 8,0), 300 мМ NaCl, от 10 до 20 мМ имидазол и 0,1 мМ EDTA]. Белок с меткой his ₆ элюировали в буфере для элюции His [50 мМ трис-Cl (pH 8.0), 50 мМ NaCl, 300 мМ имидазол и 0,1 мМ ЭДТА]. Фракции, содержащие белок, объединяли, диализовали в PBS, концентрировали с использованием центробежного концентратора с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) (MWCO) (Millipore) и мгновенно замораживали в жидком азоте.

Для очистки немаркированного убиквитина ДНК убиквитина человека субклонировали в pET28a с удалением N-концевого His ₆ -тега и добавлением C-концевого His ₆ -тега посредством сайт-направленного мутагенеза. Убиквитин-6His-tag трансформировали в клетки Rossetta (DE3) Escherichia coli .Собирали единственную колонию и инокулировали в среду Лурия-Бертани (LB) для инкубации в течение ночи. Всего 10 мл ночной культуры разводили в 1 литре свежего LB и выращивали до OD ₆₀₀ = 0,4, и добавляли 1 мМ IPTG. Клетки дополнительно инкубировали при 16 ° C в течение 16 часов. Клетки осаждали и очищали гранулами Ni-NTA с последующим удалением С-концевого слитого белка путем инкубации в течение ночи с His-USP2cc. His-USP2cc и С-концевой слитый белок удаляли связыванием Ni-NTA.

Для очистки фосфорилированного убиквитина клетки BL21 (DE3) ΔserC котрансформировали с помощью pNHD_Ub66TAG и pUC_pThrRS_SeptRNAv2.0CUA_OXB20-PduX_EFSep. Собирали единственную колонию и инокулировали в LB для инкубации в течение ночи. Всего 20 мл ночной культуры разводили в 1 литре свежего LB и выращивали до OD ₆₀₀ = 0,6 и добавляли 1 мМ IPTG. Клетки дополнительно инкубировали при 37 ° C в течение 6 часов и осаждали перед очисткой, как описано выше.

Проверка очищенного фосфорилированного убиквитина масс-спектрометрией

И Ub, и pUb диализовали до H ₂ O.Образцы белка загружали в режиме ввода U-pick-up в колонку Agilent Zorbax 300SB-C3 5 мкм, 150 мм на 0,5 мм. Система сверхвысокопроизводительной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) Dionex Ultimate 3000 (насос NCS-3500RS и автоматический пробоотборник WPS-3000PL) использовалась для хроматографии с обращенной фазой, где растворителем A был 100% H ₂ O и 0,1% муравьиная кислота (FA ), а растворитель B — 100% ацетонитрил (ACN) и 0,1% FA. Высокоэффективная жидкостная хроматография проводилась в режиме капиллярного потока со скоростью потока 12 мкл / мин.Был использован 25-минутный линейный градиент (от 0 до 2 минут, 10% B; увеличился до 90% B за 13 минут, удерживался на уровне 90% B в течение 5 минут, снова увеличился до 10% B за 1 минуту, и последний раз удерживался на 10% B в течение 4 мин). Сопряженный масс-спектрометр с ионной ловушкой Thermo LTQ-XL работал в режиме сканирования с использованием программного обеспечения Xcalibur v2.6. Глобальные параметры были следующими: источник ионов, ESI; режим ионизации, положительный; напряжение распыления 5000 В; температура ионообменной трубки 275 ° C; оболочка газовая 8, вспомогательная газовая 1; трубчатая линза, 135 В; цель автоматической регулировки усиления (АРУ) составляла 3 × 10 ⁴ ; максимальное время впрыска составляло 10 мс; тип данных был профилем; и диапазон сканирования составлял от 500 до 200 отношения масса / заряд ( м / z ).Сырые файлы загружали и обрабатывали с помощью программного обеспечения Protein Deconvolution (Thermo).

Анализ убиквитинирования in vitro

Вкратце, E1 (60 нМ), обозначенный E2 (200 нМ), и RNF8 (300 нМ) или RNF168 (300 нМ) инкубировали с убиквитином (10 мкМ) при 30 ° C в буферах, содержащих 25 мМ трис-HCl (pH 7,4), 2 мМ аденозин-5′-трифосфат (АТФ), 5 мМ MgCl ₂ , 5 мМ MnCl ₂ и 0,1 мМ дитиотреитол (DTT). Протеинкиназы (100 нг) были включены в 50-мкл реакционной смеси, как указано, для проверки их действия на убиквитинирование.

Анализ киназы in vitro

Очищенные протеинкиназы (100 нг) инкубировали с 1 мкг E1, E2, E3 или убиквитина в буфере для киназной реакции [15 мМ Hepes (pH 7,0), 1 мМ дитиотреитол, 5 мМ MgCl. ₂ , 5 мМ MnCl ₂ и 1 мМ АТФ] при 30 ° C в течение 30 мин. Продукт разделяли с помощью SDS-PAGE или PAGE с фос-меткой.

Анализ зарядки E2

Фосфорилированный убиквитин или нефосфорилированный убиквитин (40 мкМ) инкубировали с 4 мкМ UbcH5c, 0,1 мкМ E1 и 2 мМ Mg-ATP в течение указанного времени.Реакцию останавливали буфером для образцов без DTT. Образцы разделяли на SDS-PAGE и гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим.

Анализ разряда E2

Ubc5Hc, заряженный Ub (5 мкг), смешивали с ub-His6 или фос-Ub-His6 с RNF8 или буфером в качестве контроля в буфере 50 мМ трис / HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ , 1 мкМ ZnCl ₂ и 1 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP). Образцы останавливали в определенное время и анализировали с помощью SDS-PAGE.

Идентификация сайтов фосфорилирования на убиквитине после анализа киназы in vitro

Убиквитин фосфорилировали с помощью MAP4K4 in vitro и запускали на геле с фос-меткой. Полосы фосфорилированного убиквитина разрезали, и расщепление трипсином в геле проводили, как описано ( 44 ) с модификациями. После того, как гели были тщательно промыты водой, гели вырезали, нарезали кубиками 2 × 2 мм и обесцвечивали 1 мл 50 мМ бикарбоната аммония (AMBC) / 50% ACN при перемешивании в течение 1 часа; затем гели трижды промывали 1 мл 50 мМ AMBC / 50% ACN.Последняя промывка 100% ACN была проведена для обеспечения полного обезвоживания геля. Раствор трипсина (20 нг / мкл) готовили на льду с использованием предварительно охлажденных 50 мМ AMBC (pH 8,0). Затем к кусочкам геля добавляли раствор трипсина примерно в эквивалентном объеме и инкубировали на льду в течение 30 мин. Еще один 1-кратный объем раствора трипсина добавляли к образцам гелей и инкубировали еще 1 час на льду для общего времени инкубации 1,5 часа перед переносом образцов на 37 ° C для разложения в течение ночи. Дайджесты гасили и экстрагировали добавлением 50 мкл 50% ACN / 0.3% FA в течение 1 часа при встряхивании. Расщепленные пептиды собирали в свежие пробирки Protein LoBind, и дополнительную стадию экстракции проводили с 80% ACN / 0,3% FA в течение 30 минут. Экстрагированные пептиды объединяли и сушили в SpeedVac.

Образцы загружали с помощью пользовательской программы в упакованную дома колонку Luna C18 размером 75 мкм × 200 мм (Emitter от New Objective, Woburn, MA; частицы Luna C18 от Phenomenex, Torrance, CA). Систему УВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (насос NCS-3500RS и автоматический пробоотборник WPS-3000PL) использовали для хроматографии с обращенной фазой, где растворитель A представлял собой 100% h3O и 0.1% FA, а растворитель B был 100% ACN и 0,1% FA. Использовался 40-минутный линейный градиент (0 мин, 2% B, скорость потока 1 мкл / мин; 5 минут, 2% B, скорость потока 1 мкл / мин; 5,5 мин, 2% B, скорость потока 0,3 мкл / мин; 7 мин, 7% B, скорость потока 0,3 мкл / мин; 30 мин, 30% B, скорость потока 0,3 мкл / мин; 31 мин, 90% B, скорость потока 1 мкл / мин; 35 мин, 90% B, 1 мкл / мин; 36 мин, 2% B, скорость потока 1 мкл / мин; 40 мин, 2% B, скорость потока 1 мкл / мин). Сопряженный масс-спектрометр Thermo Fusion Lumos работал как в зависимом от данных, так и в целевом режиме МС / МС с использованием Xcalibur v4.2 программное обеспечение. Глобальные параметры были следующими: источник ионов, NSI; режим ионизации, положительный; напряжение распыления 2100 В; температура ионообменной трубки 275 ° C; ни защитный газ, ни вспомогательный газ не использовались. Для режима, зависящего от данных, (i) разрешение масс-спектрометрии (MS1) составляло 60000, диапазон сканирования составлял от 300 до 1800 мГц, радиочастотная (RF) линза (%) 60, цель AGC 4,0 × 10 ⁵ , максимальное впрыскивание время 50 мс, порог интенсивности 5,0 × 10 ⁴ , динамическое исключение 15 с; (ii) квадруполь режима изоляции, окно изоляции 2 m / z, энергия столкновения более высокой столкновительной диссоциации (HCD) 35, разрешение орбитальной ловушки 7500, цель AGC 1.0 × 10 ⁵ и максимальное время впрыска 100 мс. Для целевого режима МС / МС окно изоляции составляло 1,6 м / z, режим изоляции был квадрупольным, детектор был орбитальной ловушкой, тип активации был HCD с энергией столкновения 35%, разрешение орбитальной ловушки составляло 30 000; диапазон сканирования составлял от 300 до 1800 m / z, цель AGC составляла 1 × 10 ⁵ , а максимальное время впрыска составляло 50 мс. Необработанные файлы были проанализированы по последовательности белка убиквитина человека на предмет фосфорилирования в Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher Scientific).

Генерация антител

Пептид антигена (NIQKESpTLHLVLRC) был синтезирован с помощью пептида 2.0 и был конъюгирован с гемоцианином моллюска улитки в качестве иммуногена, и кроликов иммунизировали конъюгированным пептидом. Антисыворотки подвергали аффинной очистке с помощью набора для иммобилизации и очистки AminoLink Plus (Pierce).

Phos-tag PAGE assay

Для обнаружения фосфорилированных белков с помощью SDS-PAGE использовали 12% полиакриламидные гели, содержащие 25 мкМ фос-tag-акриламида (Wako Chemicals) и 50 мкМ MnCl ₂ .После электрофореза акриламидные гели с фос-меткой промывали при осторожном встряхивании в буфере для переноса, содержащем 0,01% SDS и 1 мМ EDTA, в течение 10 минут, а затем инкубировали в буфере для переноса, содержащем 0,01% SDS без EDTA, в течение 10 минут в соответствии с протоколом производителя. Белки переносили на мембраны из поливинилидендифторида и исследовали с помощью обычного иммуноблот-анализа.

Иммуноблоттинг и иммунопреципитация

Мы приготовили клеточные лизаты и выполнили иммунопреципитацию и иммуноблоттинг, как описано ранее ( 45 ).Вкратце, клетки лизировали буфером NETN [20 мМ трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 0,5% Nonidet P-40], содержащим 50 мМ β-глицерофосфата, 10 мМ NaF и пепстатин A и апротинин (по 1 мг / мл). Лизаты целых клеток центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 мин. Лизаты цельных клеток инкубировали с 2 мкг антитела и гранулами протеина А или протеина G сефарозы (Amersham Biosciences) в течение 2 часов или в течение ночи при 4 ° C. Затем иммунокомплексы трижды промывали буфером NETN и разделяли с помощью SDS-PAGE.Иммуноблоттинг выполнялся по стандартным процедурам.

Иммунофлуоресценция

Для визуализации ИК-индуцированных очагов клетки культивировали на покровных стеклах и обрабатывали 1-серым (Гр) облучением с последующим восстановлением в течение 1 часа. Затем клетки промывали PBS, фиксировали 3% параформальдегидом в течение 15 минут и повышали проницаемость в 0,5% растворе тритона в течение 30 минут при комнатной температуре. Образцы блокировали 5% козьей сывороткой, а затем инкубировали с первичным антителом при 4 ° в течение ночи. Образцы промывали трижды и инкубировали со вторичным антителом при 37 ° в течение 30 мин.Клетки окрашивали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации ядерной ДНК. Покровные стекла помещали на предметные стекла с раствором против выцветания.

Получение изображения контролировалось программой MetaXpress (Molecular Devices). Слой клеток детектировался автофокусом. Чтобы покрыть все ядро, мы получили 30 срезов z с шагом 0,2 мкм вокруг положения автофокуса. Изображения Z-стека были спроецированы и проанализированы с использованием функции Custom Module Editor программного обеспечения MetaXpress (Molecular Devices, V6.2). Для обнаружения ядер была создана ядерная маска с использованием окрашивания DAPI и соответствующих настроек ядерной площади, периметра и интенсивности. Затем ядерную маску использовали для измерения нескольких характеристик, основанных на интенсивности для всех считываний, и для измерения свойств индуцированных повреждением ДНК очагов в ядрах. Обнаружение очагов проводилось с использованием морфологической фильтрации с последующей сегментацией объектов на основе пороговых значений. Значения на основе отдельных ячеек были экспортированы в электронные таблицы Excel для анализа данных.

Анализ образования колоний

Гидрогели различной жесткости на покровном стекле помещали в шестилуночный планшет, и от 500 до 5000 клеток высевали в трех экземплярах в каждую лунку шестилуночного планшета. Шестнадцать часов спустя клетки подвергали воздействию инфракрасного излучения или обрабатывали указанными химиотерапевтическими препаратами и инкубировали в течение 10-14 дней при 37 ° C для образования колоний. Колонии окрашивали метиленовым синим и подсчитывали. Результаты были нормализованы по эффективности покрытия.

Анализ апоптоза

Прилипшие клетки обрабатывали трипсином до отдельных клеток и промывали теплым PBS.Набор для обнаружения апоптоза флуоресцеина изотиоцианат (FITC) –аннексин V (BD Bioscience) использовали в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, плавающие клетки ресуспендировали в связывающем буфере до конечной плотности 10 ⁶ клеток / мл. FITC-аннексин (5 мкл) и PI (5 мкл) добавляли к 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 10 ⁵ клеток. Суспензию клеток перемешивали осторожным встряхиванием, а затем инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Затем добавляли 400 мкл связывающего буфера и клетки анализировали проточной цитометрией с использованием проточного цитометра Attune NxT (Thermo Fisher Scientific).

Анализы репарации ДНК и анализ сортировки клеток с активацией флуоресценции

Клетки, экспрессирующие DR-GFP (для HR) или pEGFP-Pem1-Ad2 (для NHEJ), высевали из расчета 5 × 10 ⁵ клеток на 10-сантиметровую чашку и были культивируют 48 часов. Затем клетки трансфицировали 5 мкг I-Sce I (для индукции DSB), 15 нг mCherry (в качестве внутреннего стандарта для мониторинга эффективности трансфекции) и указанными плазмидами. Через восемь часов после трансфекции клетки обрабатывали трипсином и высевали на ЕСМ с низкой или высокой жесткостью.Эффективность репарации DSB анализировали с помощью сортировки клеток с активацией флуоресценции на проточном цитометре Attune NxT (Thermo Fisher Scientific). Эффективность гомологичной рекомбинации или NHEJ определяли как соотношение клеток GFP ⁺ и клеток DsRed ⁺ , соответственно. Было подсчитано не менее 20 000 клеток. Эксперименты проводили в трех экземплярах.

Анализы нейтральных комет

Набор для анализа одноклеточного гель-электрофореза для анализа комет (Trevigen) использовали в соответствии с протоколом производителя.Вкратце, клетки облучали 10 Гр ИК или без него и восстанавливали в течение указанного времени при 37 ° С. Клетки собирали и дважды промывали ледяным PBS; 1 × 10 ⁵ / мл клеток объединяли с 1% легкоплавкой (LM) агарозой при 37 ° C в соотношении 1:10 (об. / Об.) И сразу же пипеткой наносили на предметные стекла. Для лизиса клеток слайды погружали в буфер для лизиса на ночь при 4 ° C. Затем предметные стекла подвергали электрофорезу при 21 В в течение 45 мин и окрашивали в SYBR в течение 20 мин. Все изображения были сделаны с помощью флуоресцентного микроскопа и проанализированы ImageJ с OpenComet.

Приготовление полусинтетических гидрогелей на основе гиалуронана

В асептических условиях Гликозил (ESI Bio, GS222), Gelin-S (ESI Bio, GS231) и Extralink (ESI Bio, GS3006) растворяли в дегазированной воде (ESI Bio , GS240) в соответствии с инструкциями производителя. Для изготовления мягких гидрогелей исходные концентрации Glycosil (10 мг / мл), Gelin-S (10 мг / мл) и Extralink (5 мг / мл) были сделаны в соответствии с инструкциями производителя. Для получения жестких гидрогелей концентрированные исходные количества Glycosil и Extralink были приготовлены путем солюбилизации в уменьшенных объемах, чтобы получить 2 × Glycosil и 5 × Extralink.Перед использованием из каждого флакона отбирали аликвоты для приготовления растворов с соотношением 1: 5 Extralink (гликозил + гелин-S) и 5 ​​× Extralink (2 × гликозил + гелин-S) для мягких и жестких гидрогелей соответственно. Для всех условий количество Gelin-S поддерживалось постоянным, чтобы гарантировать одинаковое количество сайтов связывания клеток на основе желатина.

Исследование на мышах in vivo с использованием ингибитора LOX BAPN

Все эксперименты на животных проводили в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по уходу и использованию институциональных животных клиники Мейо.Клетки T1 опухоли молочной железы мыши 4 (1 × 10 ⁶ ) инъецировали в молочную железу мышей Balb / c. Через две недели после инъекции (размер опухоли около 100 мм ³ ) мышам внутрибрюшинно вводили цисплатин в дозе массы тела (6 мг / кг) дважды в неделю с или без BAPN (3 мг / кг; Spectrum), вводимым в питьевая вода. Рост опухоли измеряли с помощью штангенциркуля Вернье в указанные моменты времени после инъекции, и объем опухоли рассчитывали как длина × ширина × высота / 2.Через четыре недели мышей умерщвляли, опухоли удаляли и взвешивали.

Исследование на мышах in vivo с использованием гидрогеля

Клетки MDA-MB-231 (5 × 10 ⁶ ) в 20 мкл суспензий PBS вводили в 200 мкл мягких и жестких составов, как описано при приготовлении гидрогелей. После непродолжительного гелеобразования (5 мин) при комнатной температуре насыщенные клетками гидрогели вводили подкожно бестимусным голым мышам. Мышам внутрибрюшинно вводили цисплатин в дозе массы тела (1 мг / кг) два раза в неделю.Рост опухоли измеряли с помощью штангенциркуля Вернье в указанные моменты времени после инъекции, и объем опухоли рассчитывали как длина × ширина × высота / 2. Через пять недель мышей умерщвляли, опухоли удаляли и взвешивали.

Измерения АСМ

Жесткость гидрогеля оценивалась с помощью атомно-силового микроскопа Bioscope Catalyst (Bruker) с радиусом 2,5 мкм и сферическим наконечником АСМ (Novascan). Жесткость пружины наконечника АСМ была определена на уровне ~ 120 пН / нм методом тепловых флуктуаций ( 46 ).Образцы гидрогеля погружали в PBS и вдавливали при низкой скорости вдавливания (0,5 Гц) с усилием срабатывания 5 нН. Двадцать пять силовых кривых были выполнены на площади 100 мкм на 100 мкм (сетка из 5 × 5 точек, разделенных расстоянием 20 мкм) с использованием MIRO 2.0 (NanoScope 9.1; Bruker). Модуль упругости (модуль Юнга) E был затем извлечен из каждой кривой силы путем подгонки (программное обеспечение NanoScope Analysis, v1.8, Bruker) с контактной моделью Герца для сферического индентора и следуя соотношению (уравнение.1) E = 34 (1-ν2) R1 / 2δ3 / 2F (1) с R в качестве радиуса кончика, ν коэффициент Пуассона, определенный как 0,45 для гидратированных гидрогелей, и δ как отпечаток образца. Всего было проанализировано две области на образец гидрогеля, и были приготовлены два образца на значение жесткости гидрогеля ( n = 3).

Обнаружение фосфорилирования убиквитина в клетках с помощью MS

Клетки HEK293 высевали на гидрогель 30 и 1 кПа на 24 часа. Клетки дважды промывали ледяным PBS и собирали в 10 мМ трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ глицерин-2-фосфат, 50 мМ фторид натрия, 5 мМ пирофосфат натрия, 0,5 мМ EGTA, 1 мМ ортованадат натрия, 5 мМ TCEP, 1 мМ PMSF, апротинин (1 мкг / мл), лейпептин (1 мкг / мл) и коктейль ингибиторов фосфатазы. Лизаты клеток загружали на SDS-PAGE. Всю полосу разрезали и проводили расщепление трипсином в геле, как описано ( 44 ) с модификациями. После того, как гели были тщательно промыты водой, гели вырезали, нарезали кубиками 2 × 2 мм и обесцвечивали 1 мл 50 мМ AMBC / 50% ACN при перемешивании в течение 1 часа; затем гели трижды промывали 1 мл 50 мМ AMBC / 50% ACN.Последняя промывка 100% ACN была проведена для обеспечения полного обезвоживания геля. Раствор трипсина (20 нг / мкл) готовили на льду с использованием предварительно охлажденных 50 мМ AMBC (pH 8,0). Затем к кусочкам геля добавляли раствор трипсина примерно в эквивалентном объеме и инкубировали на льду в течение 30 мин. Еще один 1-кратный объем раствора трипсина добавляли к образцам гелей и инкубировали еще 1 час на льду для общего времени инкубации 1,5 часа перед переносом образцов на 37 ° C для переваривания в течение ночи. Дайджесты гасили и экстрагировали добавлением 50 мкл 50% ACN / 0.3% FA в течение 1 часа при встряхивании. Расщепленные пептиды собирали в свежие пробирки Protein LoBind, и дополнительную стадию экстракции проводили с 80% ACN / 0,3% FA в течение 30 минут. Экстрагированные пептиды объединяли и сушили в SpeedVac.

Образцы были обработаны для МС и проанализированы, как описано выше (см. Раздел «Валидация очищенного фосфорилированного убиквитина»).

Статистический анализ

Статистический анализ был использован для подтверждения основных выводов в этом исследовании.Если не указано иное, все эксперименты проводили не менее трех раз. Размер выборки для каждого эксперимента указан в соответствующих подписях к рисункам и / или ранее и, если не указано иное, представляет собой биологические повторения или независимые эксперименты, выполненные в разные дни, каждый с техническими трехкратными повторениями. Все значения представлены как средние значения ± SEM или SD, как указано. Статистическая значимость для всех парных сравнений оценивалась с помощью двустороннего критерия Стьюдента t или двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA), значение P <0.05 считалось значимым, а P <0,01 считалось очень значимым. Насколько нам известно и наблюдений, все сделанные биохимические измерения предоставили данные, которые имеют нормальное распределение, и между группами существует аналогичная дисперсия.

Благодарности: Мы благодарим JW Chin (Лаборатория молекулярной биологии Совета медицинских исследований, Великобритания), K. Guan (Калифорнийский университет в Сан-Диего, Калифорния) и ZJ Chen (Юго-западный медицинский центр Техасского университета) за предоставленные реагенты. в этом исследовании. Финансирование: Это исследование частично финансировалось Фондом исследования рака Братского Ордена Орлов (доктором медицины), номер гранта FP00089365. Вклад авторов: M.D. и Z.L. разработал и интерпретировал эксперименты и написал рукопись. M.D., J.L., T.L., Y.Z., D.S., S.N., S.L. и J.K. проводил эксперименты. D.J.T. и P.W.V. помог разработать эксперименты. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах.Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Тромбоспондин-4 контролирует сборку матрикса во время развития и восстановления мышечно-сухожильных соединений

1) Авторы предполагают, что Tsp4b взаимодействует только с ламинином и / или интегринами, связывающими коллаген. Почему это предположение сделано с учетом взаимодействия между тромбоспондинами и фибронектином? Для авторов существуют инструменты, позволяющие исследовать, какие интегрины взаимодействуют с Tsp4b. Определение механизмов расширит рамки.Если у авторов есть веские аргументы в пользу отказа от исследования Fn, это необходимо представить последовательным образом .

Мы не собираемся утверждать, что Tsp4b взаимодействует только с ламинином или коллагеном. Взаимодействие Tsp с различными матричными белками хорошо изучено. Мы попытались изучить локализацию Fn в эмбрионах рыбок данио с дефицитом Tsp4b, используя различные условия фиксации (4% PFA, кислота-метанол, TCA), но у нас возникли проблемы с получением доступных антител для работы. Мы пробовали антифибронектин (MP Biomedicals LLC, кат.55066), анти-фибронектин h400 (биотехнология Санта-Крус, кат. № SC-9068) и анти-фибронектин (Sigma Aldrich, кат. № F3648), но все три не смогли показать какой-либо специфический сигнал на границах сомитов у эмбрионов дикого веса (Garavito -Aguilar et al., 2010). Предыдущие исследования показали, что Tsp4 крысы взаимодействует с ламинином (Lam), фибронектином (Fn), коллагенами (Col) и матриллином in vitro (Narouz-Ott et al., 2000). Границы сомитов рыбок данио содержат Lam, Fn и Cols, которые становятся сильно локализованными на границах у личинок старше 3 dpf.

Доступность подходящих антител также ограничила нашу способность изучать интегрины (Itgs) у рыбок данио. Среди трех антител против киназы фокальной адгезии (FAK) — Anti-FAK (pY397) (каталожный номер 44-625G), Anti-FAK (pY576) (каталожный номер 44-652G), анти-FAK (pY861) (каталожный номер : 44-626G) от Invitrogen — Anti-FAK (pY861) показали специфическую локализацию на базальных концах мышечных волокон в MTJ. Это продемонстрировало, что активированная передача сигналов Itg требует передачи сигналов Tsp4b (Рисунок 4).

В нашей попытке идентифицировать рецепторы Itg для Tsp4b мы исследовали экспрессию и локализацию двух вероятных кандидатов, Itga5 и Itga6, оба экспрессируемых в эмбриональной мезодерме (Goody et al., 2012; Lackner et al., 2013). Мы получили Tg (Itga5-rfp) (подарок С. Холли) и с помощью конфокальной визуализации в реальном времени обнаружили, что Itga5 локализуется на базальных концах мышц, когда они прикрепляются. itga5-rfp Экспрессия была умеренно снижена на мембране Tsp4b-дефицитных эмбрионов, что согласуется с функцией рецептора Tsp4b (Рисунок 4 — приложение к рисунку 2A, B). Мы также приготовили гибридную конструкцию itga6-gfp из клона кДНК полной длины itga6 и инъецировали синтезированную in vitro мРНК в эмбрионы дикого типа.Мы обнаружили, что itga6-GFP локализуется по всей длине мышечных волокон, а не только на их концах, как мы могли бы представить для рецептора Tsp4b. Локализация Itga6-GFP также была немного снижена у Tsp4b-дефицитных эмбрионов (Рис. 4 — приложение к рисунку 2C, D). Эти результаты были добавлены в рукопись. Исходя из этих результатов, мы можем постулировать, что, подобно его взаимодействиям с Lam, itga5 является хорошим кандидатом на роль рецептора Tsp4b.

2) Показаны два разных фенотипа. Один из фенотипов — отслойка мышц.Вывод таков: «Наши результаты предполагают, что Tsp4b необходим для усиления и поддержания обоих типов прикреплений, но не для образования теноцитов или начального образования MTJ». Другой фенотип противоречит вышеприведенному утверждению — существуют прерывистые MTJ на ранней стадии развития мышц (20-24hpf). Tsp4b может играть роль в обоих событиях — развитии MTJ и укреплении / поддержании привязанности — но представленные данные необходимо четко интерпретировать .

Предыдущие исследования раннего развития сомитов показали, что ECM на границе сомитов и MTJ претерпевает динамические изменения с изменением уровней Fn и повышенным отложением ламининов и коллагенов (Devoto et al., 1996; Генри и др., 2005). Tsp4b взаимодействует со всеми этими компонентами ECM в MTJ и в качестве каркаса позволяет организовать эти компоненты ECM, обеспечивая прикрепление мышц как на ранних, так и на более поздних стадиях развития сомитов. Медленные мышечные волокна, которые развиваются первыми, сначала прикрепляются посредством преимущественно интегрин-зависимых взаимодействий с Fn, а позже, когда уровни Fn снижаются, взаимодействия интегрин-ламинин и интегрин-коллаген играют важную роль в прикреплении. На более поздних стадиях адгезионные комплексы дистрофин-дистрогликан также взаимодействуют с матричными компонентами MTJ (Jacoby et al., 2009). Следовательно, природа прикрепления мышц в MTJ варьируется в зависимости от стадии развития мышечных волокон и преобладающего компонента матрицы, участвующего в прикреплении. Tsp4b, как каркасный белок и интегрин-лиганд, экспрессируется с раннего сомитогенеза на протяжении взрослой жизни и модулирует организацию ECM в MTJ на каждой стадии развития от сомитогенеза.

Следовательно, вариация фенотипа между ранними и более поздними стадиями развития вероятно не из-за изменения функции Tsp4b, а из-за временных изменений в составе ECM в MTJ.Мы подчеркнули более позднюю роль в поддержании, потому что обычно мышечные прикрепления обычно формируются у Tsp4b-дефицитных эмбрионов, но различные дефекты, которые мы видим в мышечных прикреплениях и локализации Lam через 24-26 часов после оплодотворения, могут указывать на более раннюю роль. Следовательно, мы изменили наши выводы, чтобы заявить, что Tsp4b играет роль как в прикреплении мышц, так и в укреплении / поддержании ECM в MTJ.

2a) Прерывистые MTJ: Авторы показывают, что паксиллин не локализуется в MTJ на 20hpf, имеется неоднородная экспрессия ламинина и нарушается фосфорилирование Fak.Необходимо учитывать ось времени. Формируются ли начальные границы сомитов, но не поддерживаются ли они? Они не формируются? Почему одни мышечные клетки длиннее других? И почему этот фенотип не отражается на изображениях, показанных в начале? Это фундаментальный вопрос, поскольку фенотип и сделанные выводы меняются на протяжении всей рукописи. Приводит ли более низкая доза к отслоению мышц при электростимуляции, а более высокая — к порокам развития?

Начальные границы формируются и поддерживаются большей частью у Tsp4b-дефицитных эмбрионов — эмбрион, лишенный ранней локализации Lam или Pxn, обнаруживает довольно нормальную границу сомита.Отчасти проблема презентации заключается в том, что окрашивание MHC не маркирует всю медиолатеральную протяженность сомитов, поэтому не все мышечные клетки показаны на рисунках, подобных рисунку 1. Точно так же мутации в Itga5 и интегрин-связанной киназе (ilk) не влияют на формирование всех границ сомитов, и мышцы мутантов loc (ilk ^{— / —} ) также первоначально образуют прикрепления (Koshida et al., 2005; Postel et al. ., 2008; Lackner et al., 2013). По-видимому, ранние дефекты, которые мы видим в локализации Lam и Pxn, не препятствуют мышцам формировать прикрепления, кроме случайного неправильно локализованного прикрепления и эктопической границы сомита.Мы изменили текст, чтобы уточнить, что Tsp4b может играть роль как в разработке MTJ, так и в укреплении / поддержке вложений.

Мышечные волокна, которые длиннее других, встречаются в точках вдоль границы сомита, где они проходят через весь дополнительный сомит, образуя соединение со следующей границей сомита. Они могут находиться в местах, где отсутствует Lam, и в этом случае отдельные волокна должны либо найти следующую границу, либо образовать эктопические соединения с соседними волокнами, как мы иногда видим у Tsp4b-дефицитных эмбрионов.

Мы выполнили инъекции Tsp4b-MO, а также тест электростимуляции в зависимости от дозы, чтобы определить оптимальное напряжение (Рисунок 2 — приложение к рисунку 1A) и оптимальные концентрации MO (Рисунок 2 — приложение к рисунку 1B). Эти выбранные условия использовались во всех экспериментах, если не указано иное.

3) Отсутствие интеграции с литературой: «Хотя организация внеклеточного матрикса в мышечно-сухожильных соединениях описана, процессы развития, лежащие в основе его создания и поддержания, изучены недостаточно.«Если цель рукописи состоит в том, чтобы лучше понять установление и поддержание ECM в MTJ рыбок данио, логичным подходом было бы убедительное описание того, что известно в модели рыбы. Это могло бы включать образование сомитов, то, что известно о передаче сигналов интегрина и изменениях матрикса при формировании MTJ, какие белки ECM, как известно, присутствуют в MTJ рыб, фенотипы, когда эти белки нарушены, и пути, которые регулируют их экспрессию. Хотя авторы полностью правы в том, что разработка MTJ не совсем понятна, они должны, по крайней мере, установить, что известно в этой области и как их результаты вносят вклад.Это также верно в отношении обсуждения — несколько лабораторий исследуют ECM на этих границах и четко изложили временной ход и некоторые клеточные и молекулярные механизмы отложения Fn и ламинина на этих границах. Какое место в этих путях занимает tsp4b?

Мы расширили Введение и Обсуждение, чтобы добавить детали относительно белков и путей, участвующих в формировании границ сомитов и прикреплении мышц.

4) Вывод о том, что пентамеризация Tsp4 необходима для мышечно-специфической передачи сигналов Itg, недостаточно хорошо подтверждается (см. Комментарии для Рисунок 7 ниже), и это должно быть либо смягчено, либо усилено дальнейшим экспериментом .

Мы провели эксперименты, чтобы проверить влияние мутации SQAS на структуру и функцию Tsp4b. Мы представили результаты этого исследования на Рисунках 1-3 выше. Вестерн-блоттинг, проведенный на экстракте белка из эмбрионов, инъецированных SQAS-gfp , и эмбрионов, инъецированных tsp4b-FLAG / tsp4b-gfp , окончательно показывает, что потеря остатков цистеина предотвращает образование пентамеров Tsp4b. Мы окрашивали Tsp4b-MO-инъецированные эмбрионы, инъецированные полноразмерной мРНК SQAS с анти-Tsp4b, и не обнаружили белка на границах сомитов, в отличие от Tsp4b-дефицитных эмбрионов, инъецированных полноразмерной мРНК tsp4b wt.Чтобы проверить синтез и секрецию мутантного белка, мы сделали GFP-слияния мРНК wt и SQAS. Полноразмерные мРНК tsp4b — gfp или SQAS-gfp вводили совместно с Tsp4b-MO и визуализировали вживую на конфокальном микроскопе на нескольких этапах. Обе конструкции экспрессировались на ранних стадиях развития (хвостовая зачатка), в то время как через 36 часов после оплодотворения SQAS-GFP не локализовался на границе сомита — была слабая флуоресценция по всему эмбриону — в отличие от Tsp4b-GFP. SQAS-GFP также нарушает локализацию Tsp4b-FLAG на границах сомитов при совместной инъекции Tsp4b-дефицитным эмбрионам.Эти результаты убедительно показывают, что мотив CQAC в CCD необходим для пентамеризации белка, который необходим для правильной локализации и функции на границе сомита. Мы добавили результат как рисунок 6C, рисунок 6 — дополнение к рисунку 1, рисунок 6 — дополнение к рисунку 2, рисунок 6 — приложение к рисунку 3 и описали результат.

5) Могут ли авторы объяснить свой выбор мутации с KGD на KGE? Учитывая, что KGD, по-видимому, заменяет RGD, возможно, удивительно, что KGE не может заменить KGD, учитывая, что аминокислоты D и E тесно связаны между собой .

Предыдущие исследования RGDs в Fn и др. Лигандах Itg показали, что мутация RGD в RGE отменяет их способность взаимодействовать с Itg и способствовать передаче сигналов ниже по течению. Взаимодействия Itg с RGD, но не с RGE, достаточны, чтобы способствовать активации mTOR и фосфорилированию белка S6, которые являются ключевыми шагами для адгезии фибробластов с лигандами Itg (Balasubramanian and Kuppuswamy, 2003). Мутация RGD в RGE в рецепторе P2Y2R ингибирует его ассоциацию с Itgs (Erb et al., 2001). Мыши FN ^{RGE / RGE} демонстрируют фенотип, сходный с фенотипом мышей с дефицитом Itga5 / Itgb1 (Takahashi et al., 2007).

6) Фигуры

Рисунок 1 — дополнение к рисунку 2 : Описание здесь относится к «изолированным ячейкам», но они выглядят как группы ячеек на рисунке. Уточните пожалуйста .

Мы заменили «изолированные ячейки» на «группы ячеек» в легенде рисунка.

Рисунок 5 и Рисунок 6 : Было бы полезно иметь флуоресцентные изображения эмбрионов, инъецированных MO + РНК, в дополнение к контрольным и эмбрионам, инъецированным только MO (панели 5I и 6I) и для подтверждения данных в панели 5J .

Мы добавили изображения MO + РНК на панели рисунков 4 и 5 и соответственно обновили текст и аннотации в легенде и основном тексте.

Рисунок 7 Легенда: Легенда для панели B должна указывать на то, что эти эмбрионы подверглись стимуляции, как указано в тексте .

Мы добавили пункт «при стимуляции» в легенде к рисунку 7.

Рисунок 7C неубедителен. Должны быть показаны данные для инъецированных только МО эмбрионов (как для , рис. 5I ), и следует измерять спасение этих эмбрионов, а не неинъекционных контрольных.Значения значимости между экспериментальным и контрольным образцами на этом графике являются слабыми, что указывает на то, что на самом деле РНК SQAS может произвести довольно разумное восстановление уровней 90–117 как FAK, так и ламинина.

Мы включили данные инъекции контроль + tsp4b-MO в рисунок 4N и предоставили значимое значение P, сравнивая% отсоединенных мышц с ilk + tsp4b-MO (рисунок 4N). Посоветовавшись со статистиком, мы поняли, что наш экспериментальный результат потребует, чтобы t-тесты проводились как «односторонние», и после внесения этого изменения в t-тест для данных на Рисунке 6 — добавлении к рисунку 3, мы получили значимое P-значение <0.05. Соответственно, мы внесли изменения в легенду рисунка. В нашем анализе Tsp4b-дефицитных эмбрионов по локализации FAK и Lam и последующему спасению с помощью полноразмерной мРНК tsp4b, мы обнаружили, что частично восстановленные уровни FAK и Lam существенно не отличались от уровней wt. На рис. 6 – рисунок в приложении 3, спасение Tsp4b-дефицитных эмбрионов с помощью полноразмерной РНК SQAS показало значительные изменения в уровнях FAK и Lam, предполагая, что спасение не было успешным.

Рисунок 8E-H : На этих панелях показаны стимулированные мышцы, как указано в легенде, и если да, то при каком напряжении?

Панели E-H на рисунке 7 — это эмбрионы, которые не подвергались стимуляции.Панель I показывает процент эмбрионов с отслоением при стимуляции. Мы изменили легенду, чтобы прояснить эти моменты.

https://doi.org/10.7554/eLife.02372.025

Лапароскопическая пластика грыжи пищеводного отверстия диафрагмы с использованием пластыря бесклеточного дермального матрикса человека: наш первый опыт

Задний план: Лапароскопическая пластика большой грыжи пищеводного отверстия диафрагмы с последующей антирефлюксной процедурой в настоящее время является золотым стандартом лечения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни.Однако признано, что рецидивирующая грыжа пищеводного отверстия диафрагмы и миграция обертки являются основными источниками хирургических неудач у этих пациентов. Некоторые описали уменьшение таких случаев с наложением небиоразлагаемых протезов поверх первичной круропластики. Этот протезный материал может быть связан с чреспищеводными эрозиями и эрозиями желудка, а также с более высокой частотой послеоперационной дисфагии и боли в груди по сравнению с простой круропластикой наложением швов. Целью данного исследования является сравнение закрытия пищеводного отверстия диафрагмы с биоразлагаемым пластырем (бесклеточный дермальный матрикс) и простой шовной курапластикой у пациентов, перенесших лапароскопическую антирефлюксную операцию.

Методы: В это исследование проспективно были включены 44 пациента. Двадцать два последовательных пациента, перенесших большую пластику грыжи пищеводного отверстия диафрагмы (> 5 см) и фундопликацию только с помощью первичной шовной круропластики (группа 1), сравнивались с 22 последовательными пациентами, перенесшими ту же процедуру с шовной круропластикой, усиленной накладкой бесклеточного пластыря дермального матрикса (группа 2). ).Две группы сравнивались по демографическим характеристикам, размеру грыжи пищеводного отверстия диафрагмы, баллам симптомов до и после операции, исследованиям pH, времени операции и рецидивам грыжи пищеводного отверстия диафрагмы.

Полученные результаты: Пациенты в обеих группах были хорошо сопоставимы по возрасту, весу, росту и размеру грыжи пищеводного отверстия диафрагмы. В обеих группах были одинаковые дооперационные показатели манометрии пищевода, 24-часового мониторинга pH и оценки симптомов.Среднее время операции составило 108 минут в группе 1 и 121 минуте в группе 2. Серьезных осложнений не было ни в одной из групп. Средний срок госпитализации в обеих группах составил 1 день. Послеоперационные исследования pH и данные оценки симптомов были значительно улучшены в обеих группах. Не было значимой разницы в оценке послеоперационных симптомов дисфагии между двумя группами. Двум пациентам (по одному в каждой группе) в послеоперационном периоде была выполнена дилатация пищевода по поводу легкой дисфагии. В группе 1 у 2 пациентов (9%) была недостаточность Ниссена с рецидивами грыжи пищеводного отверстия диафрагмы через 6 месяцев после операции.В группе 2 рецидивов за период наблюдения не было.

Выводы: Наши первые результаты показывают, что пластика грыжи пищеводного отверстия диафрагмы, усиленная бесклеточным пластырем дермального матрикса, может снизить частоту рецидивов грыжи и миграции обертки. Кроме того, увеличение послеоперационной дисфагии, боли в груди и эрозий пищевода, связанных с неразлагаемой сеткой, не наблюдалось у пациентов с бесклеточным пластырем дермального матрикса на данный момент в нашем последующем наблюдении.Однако необходимы дальнейшие исследования материала для этого конкретного приложения, а также более длительное наблюдение.

Ремонт, реконструкция и абляция ногтевой матрицы

Восстановление, реконструкция и абляция ногтевой матрицы

Рубен А. Буэно младший

Элвин Г. Зук

АНАТОМИЯ

• 
  Ноготь выполняет несколько функций: защищает периферическое кровообращение, регулирует кровообращение. , и способствуя сенсорной обратной связи кончика пальца. ⁹ , ¹⁰
  
• 
  Перионихий включает ногтевую пластину, ногтевое ложе, гипонихий, эпонихий и складку, а также паронихий (фиг.1).
  

• Проксимальная часть матрицы ногтя (приблизительно одна четвертая длины ногтя) — это зародышевый матрикс, а дистальные три четверти — стерильный матрикс. Зародышевый матрикс производит около 90% ногтя, тогда как стерильный матрикс дает оставшиеся 10% ногтя и производит клетки на нижней поверхности ногтя, ответственные за прилегание ногтя.

  
  

• Гипонихий — это кожа дистальнее ногтевого ложа, паронихий — это кожа с каждой стороны ногтя, а эпонихий — это кожа над ногтевым валиком.

  
  

• Ногтевое ложе прикреплено к надкостнице дистальной фаланги.

ПАТОГЕНЕЗ

• Основными причинами деформации ногтей являются травмы и опухоли.

  
  
• 
  Средний палец — это наиболее часто травмируемый палец из-за его длины. ¹³
  

• Неадекватное лечение в острых условиях часто приводит к деформации ногтя.

  
  
• 
  Сопутствующий перелом дистальной фаланги встречается в 50% случаев травм ногтевого ложа. Этот тип травмы следует рассматривать как открытый перелом и лечить как таковой с помощью орошения и удаления дефектов, уменьшения перелома и фиксации, если необходимо, и восстановления ногтевого ложа (рис. 2). ¹ , ⁴
  

• Рубцевание может привести к расщепленной деформации ногтя.

  
  

• Отсутствие матрицы ногтя может привести к отслоению ногтя.

  
  

• Отсутствие опоры со стороны дистальной фаланги приводит к деформации крючкообразного стержня.

  
  

• Доброкачественные опухоли (гломусная опухоль, ганглии дистального межфалангового сустава) и злокачественные опухоли (плоскоклеточный рак, меланома) могут влиять на внешний вид ногтей.

ИСТОРИЯ ПАЦИЕНТА И ФИЗИЧЕСКИЕ ВЫВОДЫ

• 
  Травматическое повреждение перионихия обычно вызывается раздавливанием. ¹ , ⁴
  

• При острой стадии необходимо оценить состояние всего кончика пальца: качество кожи, наличие подногтевой гематомы, качество матрикса ногтя, наполнение капилляров, сенсорная функция, сгибание разгибание в дистальном межфаланговом суставе и наличие перелома дистальной фаланги.

  
  
  
  
  
  

  РИС. 3 • A. Внешний вид ногтя через 3 месяца после ремонта. Пациенты должны помнить о том, что ноготь нарастает в дистальном направлении.Б. Внешний вид ногтя через 1 год после ремонта.

  
  

• Особенности острой травмы ногтевого ложа

  
  
  
  
  • 
    Подногтевая гематома (рис. 4A, B): кровотечение под ногтем из-за разрыва ногтевого ложа
    
    
  • 
    
    

    00034 Механизм травмы обычно — раздавливание.

    
    

  • Может присутствовать сопутствующее повреждение кожи кончиков пальцев или перелом дистальной фаланги.

    
    

  • Рваные раны ногтей можно описать одним из четырех способов: простой разрыв, звездчатый разрыв, сильное раздавливание и отрыв.

    
    

  • Ремонт разрыва ногтевого ложа и фиксация перелома дистальной фаланги спицами Киршнера при нестабильном состоянии

  
  
• 
  
  
  
  

  • Качество вырванной матрицы ногтя и размер дефекта будут определять лечение.

    
    

  • Варианты лечения включают возвращение оторванной части обратно в дефект или взятие расщепленного лоскута ногтя из соседнего матрикса или большого пальца ноги. (Кожный трансплантат предотвратит прилипание нового ногтя с бороздками.)

Посттравматическая деформация ногтя

• 
  Неслипание ногтя или расслоение ногтя (рис. 4F)
  
  
  

  • Обычно из-за повреждения стерильного матрикса, который производит клетки, отвечающие за сцепление

    
    

  • Иссечение рубца и первичное закрытие или реконструкция ногтевого матрикса с помощью раздельного трансплантата большого пальца стопы

  
  
• 
  
  
  
  

  • Из-за чрезмерного натяжения в месте соединения ногтевого ложа и подонихиальной кожи и потери опоры дистальной фаланги

    
    

  • Ревизионная ампутация или реконструкция ногтевого ложа и костного трансплантата до дистального конца дистальной фаланги

  
  
• 
  
  
  
  

  • Из-за наличия остаточного зародышевого матрикса, удаленного не полностью время первичного ремонта или ревизии ампутации

    
    

  • Полная абляция или ревизионная ампутация ногтевого матрикса

  
  
• 
  Пинцетная деформация ногтя (рис.

  No related posts.